成永霞，劉貴波，顏 彬，馮玉寬*，郭素芬，王宏偉，楊向紅

(牡丹江醫(yī)學(xué)院1.病理教研室;2.解剖教研室，黑龍江牡丹江157011;3.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病理科，遼寧沈陽100011)

現(xiàn)在的觀點(diǎn)認(rèn)為，組織中氧化應(yīng)激的爆發(fā)是內(nèi)皮型一氧化氮合酶 (endothelial NO synthese，eNOS)脫偶聯(lián)發(fā)生的最主要原因［1］。關(guān)于其具體機(jī)制，有研究者認(rèn)為依賴蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶激活在介導(dǎo)糖尿病患者內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激發(fā)生和并發(fā)癥形成中起重要作用［2］。糖基化終末產(chǎn)物 (advanced glycaton end products，AGEs)可以通過糖基化終末產(chǎn)物受體 (receptor for AGE，RAGE)激活PKC，從而使腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的NADPH氧化酶表達(dá)增加［3］。而NADPH氧化酶使細(xì)胞內(nèi)活性氧 (reactive oxygen species，ROS)增加，ROS又能導(dǎo)致eNOS脫偶聯(lián)的發(fā)生，進(jìn)而引起內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂［4］。

然而，糖尿病性心肌病作為一種心臟微血管病變，AGEs是否引起心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的ROS產(chǎn)生增加從而引起eNOS脫偶聯(lián)及其分子機(jī)制仍然不清晰。以往的實(shí)驗(yàn)研究采用大血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂來闡述糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制，這種準(zhǔn)確性尚存在質(zhì)疑。因此，本實(shí)驗(yàn)將心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞作為研究主體，觀察PKC/NADPH氧化應(yīng)激途徑在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

清潔級(jí) Wistar大鼠，2～3周齡(體質(zhì)量20～30 g)，雌雄不限，由中國醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部提供(合格證:SCXKR12008-0005)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和藥物

DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司);肝素、HEPES、Ⅱ型膠原酶和 BSA(Sigma公司);兔抗大鼠vWF抗體、兔抗大鼠eNOS多克隆抗體和熒光二抗(Santa Cruz公司);NO及O2－產(chǎn)生檢測(cè)試劑盒(南京建成生物試劑公司)。

1.3 心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)

剪去左、右心房及右心室，剖開左心室，去除心臟外1/4層，Ⅱ型膠原酶與胰蛋白酶37℃消化1 h，孵育箱內(nèi)培養(yǎng)，隔天換液。

1.4 BSA-AGEs的制備［3］

20 g/L BSA與500 mmol/L葡萄糖溶于pH 7.4的PBS中混勻，并加入終濃度為0.5 mmol/L的EDTA，濾器過濾，避光孵育90 d，熒光光譜掃描檢測(cè)。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組

對(duì)照組、AGEs 100 mg/L+DPI(2.5、5 和10 μmol/L)組和 AGEs 100 mg/L+LY33531(2.5、5和10 μmol/L)組。對(duì)照組加無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.6 NO及O2－測(cè)定

按照實(shí)驗(yàn)分組加入刺激因素孵育，收集上清液備測(cè)定NO和O2－。具體步驟按照試劑盒說明書操作，721分光光度計(jì)測(cè)定各組吸光度。

1.7 免疫細(xì)胞化學(xué)法測(cè)定eNOS

實(shí)驗(yàn)操作參照S-P法，具體步驟略。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用灰度掃描值A(chǔ) value表示。

1.8 HPLC法測(cè)定BH4

將培養(yǎng)細(xì)胞中放入300 μL預(yù)冷的提取液，離心后收集上清加入等體積比的1.5 mol/L HClO4和2 mol/L H3PO4析出蛋白，離心棄去蛋白，取上清。分別在酸性條件和堿性條件下氧化，離心收集上清。分別對(duì)酸性條件下氧化和堿性條件下氧化的標(biāo)本進(jìn)行測(cè)定。酸性條件下氧化的標(biāo)本檢測(cè)出總生物喋呤包括BH4、BH2(二氫生物喋呤)和B(氧化型生物喋呤);在堿性條件下氧化的標(biāo)本可以檢測(cè)BH2和B。將BH2和B從總生物喋呤中除去即BH4含量。

1.9 2,7二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)熒光染色檢測(cè)ROS

DCFH-DA本身沒有熒光，但可以自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，細(xì)胞內(nèi)的ROS可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。用無血清的培養(yǎng)基清洗細(xì)胞兩次，再加入 DCFH-DA(1∶1 000稀釋)，37℃孵育箱中孵育20 min后胰蛋白酶消化，1 mL無血清的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)ROS的熒光強(qiáng)度。

1.10 Western blot 測(cè)定P47phox

具體步驟略。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用 eNOS/β-actin%表示。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)

貼壁細(xì)胞以大小相對(duì)均一的梭形細(xì)胞為主。細(xì)胞多呈集落生長，7 d后匯合成內(nèi)皮細(xì)胞單層，呈典型的鋪路石樣形態(tài)(圖1)。

圖1 大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)Fig 1 The primary culture of cardiac microvascular endothelial cells(×200)

2.2 NADPH氧化酶抑制劑-DPI對(duì)AGEs引發(fā)的心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS脫偶聯(lián)的影響

2.2.1 DPI對(duì)AGEs引發(fā)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞NO和O2－變化的影響:心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞用NADPH氧化酶抑制劑-DPI(2.5、5 和10 μmol/L)作用30 min后，加入 AGEs(100 mg/L)再孵育24 h，無血清培養(yǎng)基處理組做空白對(duì)照，觀察各組NO、O2－生成的變化。AGEs組較空白組NO明顯降低(P＜0.05)，而O2－生成明顯增加(P＜0.05)。隨著DPI濃度的增加，NO生成逐漸增加(P＜0.05)，而O－2生成逐漸減少(P＜0.05)(表1)。

DPI對(duì)AGEs引發(fā)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS變化的影響:AGEs組eNOS表達(dá)較空白組明顯增高(P＜0.05)。隨著 DPI濃度增加(2.5、5和10 μmol/L)，eNOS 表達(dá)較 AGEs組逐漸減少(圖 2，表1)。

2.2.3 DPI對(duì)AGEs引發(fā)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞BH4含量變化的影響:AGEs組較空白組BH4含量明顯降低(P ＜0.01)。應(yīng)用 DPI(2.5、5 和10 μmol/L)后，而BH4隨著 DPI濃度增加而逐漸增加(P＜0.01)(表1)。

2.3 DPI對(duì)AGEs引發(fā)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS變化的影響

AGEs組較空白組 ROS表達(dá)明顯增加(P＜0.05)。隨著DPI濃度的增加，ROS表達(dá)逐漸減少(P＜0.05)(表1)。

2.4 PKC特異性抑制劑-LY33531對(duì)AGEs引發(fā)的心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS脫偶聯(lián)的影響

2.4.1 LY33531對(duì)AGEs引發(fā)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞NO和O2－變化的影響:心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞用PKC 特異性抑制劑-LY33531(2.5、5和10 μmol/L)分別作用30 min后，加入AGEs(100 mg/L)再孵育24 h，無血清培養(yǎng)基處理組做空白對(duì)照。AGEs組生成NO較空白組減少(P＜0.05)，而O2－生成明顯增加(P＜0.05)。隨著LY33531濃度的增加，NO生成逐漸增加(P＜0.05)，而O2－生成逐漸減少(P＜0.05)(表2)。

表1 DPI 對(duì)AGEs引發(fā)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞NO2－/NO3－，O2－，eNOS，ROS，BH4，變化的影響Table 1 Effects of AGEs and DPI on NO2－/NO3－，O2－，eNOS，BH4，generation in cardiac microvascular endothelial cells(，n=3)

表1 DPI 對(duì)AGEs引發(fā)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞NO2－/NO3－，O2－，eNOS，ROS，BH4，變化的影響Table 1 Effects of AGEs and DPI on NO2－/NO3－，O2－，eNOS，BH4，generation in cardiac microvascular endothelial cells(，n=3)

*P ＜0.05 compaired with control;#P ＜0.05 compaired with AGEs．

ROS control 167.0±0.3 121.0±2.3 108.0±2.7 group NO2－/NO3－ O2－ eNOS BH4 537.0±0.1 40.0±0.6 AGEs 100 mg/L 91.0±0.3* 180.0±0.4* 126.0±3.5* 214.0±0.1* 61.0±0.8*DPI 2.5 μmol/L 100.0±0.7 167.0±0.6 123.0±2.8* 299.0±0.1* 49.0±0.5 5 μmol/L 154.0±0.3 131.0±0.6 118.0±1.4 409.0±0.1# 47.0±0.6 10 μmol/L 161.0±0.6# 126.0±0.7# 114.0±1.8 481.0±0.1# 43.0±0.6#

圖2 AGEs和DPI對(duì)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS表達(dá)的影響Fig 2 Effects of AGEs and DPI on eNOS protein expression in cardiac microvascular endothelial cells

表2 LY33531對(duì)AGEs引發(fā)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞NO2－/NO3－，O2－，eNOS，BH4，變化的影響Table 2 Effects of AGEs and LY33531on NO2－/NO3－，O2－，eNOS，BH4，generation in cardiac microvascular endothelial cells ± s，n=3)

表2 LY33531對(duì)AGEs引發(fā)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞NO2－/NO3－，O2－，eNOS，BH4，變化的影響Table 2 Effects of AGEs and LY33531on NO2－/NO3－，O2－，eNOS，BH4，generation in cardiac microvascular endothelial cells ± s，n=3)

**P＜0.05，與對(duì)照組相比較;#P ＜0.05，與 AGEs組比較;*P ＜0.05 compaired with control;#P ＜0.05 compaired with AGEs．

group NO2－/NO－ O2－ eNOS BH4 control 167.0±0.3 121.0±2.3 107.0±2.7 536.0±0.1 AGEs 100 mg/L 121.0±2.3 179.0±0.4* 126.0±3.5* 214.0±0.1#LY33531 2.5 μmol/L 107.0±2.7 160.0±0.6 124.0±5.7 285.0±0.1*5 μmol/L 536.0±0.1 128.0±0.5 120.0±2.4 378.0±0.2#10 μmol/L 123.0±0.3# 126.0±0.6# 113.0±1.7# 435.0±0.1#

2.4.2 LY33531對(duì)AGEs引發(fā)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS表達(dá)變化的影響:觀察到AGEs組eNOS表達(dá)較空白組明顯增高(P＜0.05)。應(yīng)用LY33531(2.5、5 和10 μmol/L)后，eNOS 表達(dá)較 AGEs組逐漸減少(P＜0.05)(表2)。

2.4.3 LY33531對(duì)AGEs引發(fā)的心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞BH4含量變化的影響:AGEs組BH4較空白組明顯降低，差異顯著(P＜0.01)。應(yīng)用 LY33531(2.5、5 和10 μmol/L)后，BH4隨著 LY33531 濃度增加而增加，差異顯著(P＜0.01)(表2)。

2.5 LY33531對(duì)AGEs引發(fā)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞NADPH氧化酶亞基-P47phox表達(dá)、ROS生成變化的影響

2.5.1 LY33531對(duì)AGEs引發(fā)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成變化的影響:AGEs組內(nèi)ROS生成較空白組明顯增加(P＜0.05)。應(yīng)用LY33531(2.5、5和10 μmol/L)后，ROS逐漸降低 (P＜0.01)(圖3)。

2.5.2 LY33531對(duì)AGEs引發(fā)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞P47phox表達(dá)變化的影響:P47phox蛋白表達(dá)在AGEs組較空白組明顯增加(P＜0.05)，隨著LY33531濃度的增加P47phox減少(P＜0.05)(圖4)。

3 討論

圖3 AGEs和LY33531對(duì)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS表達(dá)的影響Fig 3 Effects of AGEs and LY33531 on ROS expression in cardiac microvascular endothelial cells

生理及病理情況下，血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生ROS的主要來源是NADPH氧化酶［5］。在糖尿病動(dòng)物模型和患者的血管、視網(wǎng)膜和腎臟的組織中，均發(fā)現(xiàn)ROS的增高伴隨著NADPH氧化酶的活性上調(diào)和P47phox亞基的高表達(dá)［6－7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)AGEs(100 mg/L)作用24 h后，P47phox表達(dá)和ROS生成均較空白組有明顯升高，同時(shí)出現(xiàn)NO生成減少、eNOS表達(dá)增加、O2－生成增加和BH4含量減少等eNOS脫偶聯(lián)表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用NADPH氧化酶抑制劑-DPI后，P47phox表達(dá)和ROS生成均減少，而eNOS脫偶聯(lián)表現(xiàn)得到改善。這就可以也證明AGEs引發(fā)的以ROS增高為特征的氧化應(yīng)激是心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS脫偶聯(lián)的主要原因，并且NADPH氧化酶在其中發(fā)揮重要作用。

高糖激活的NADPH氧化酶主要是依賴PKC的激活［8－9］，研究認(rèn)為中性粒細(xì)胞中的 NADPH氧化酶的亞型P47phox的激活必須依賴PKC的激活［9］。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用 PKC抑制劑-LY33531后，觀察到P47phox表達(dá)和ROS生成均減少，同時(shí)eNOS脫偶聯(lián)表現(xiàn)也得到改善。提示NADPH氧化酶的表達(dá)增加是依賴PKC的，同時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知AGEs激活了心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)PKC/NADPH氧化應(yīng)激途徑。

綜合以上結(jié)果，提示在心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，AGEs引發(fā)的PKC/NADPH氧化應(yīng)激途徑是eNOS脫偶聯(lián)發(fā)生的重要原因，而這種氧化應(yīng)激和eNOS脫偶聯(lián)導(dǎo)致了NO生物利用度的減少，從而發(fā)生內(nèi)皮依賴性舒張功能紊亂，可能導(dǎo)致糖尿病性心肌病的發(fā)生，并成為其重要發(fā)病機(jī)制。

圖4 AGEs和LY33531對(duì)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞P47phox蛋白表達(dá)的影響Fig 4 Effects of AGEs and LY33531 on P47phox expression in cardiac microvascular endothelial cells

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