任路平，胡志娟，宋光耀*，陳樹春，魏立民

(河北省人民醫(yī)院1.內(nèi)分泌一科;2.腎內(nèi)科，河北石家莊050051)

非酒精性脂肪肝(non-alcholic fatty liver disease，NAFLD)的發(fā)生發(fā)展與胰島素抵抗(insulin resistance，IR)密切相關(guān)。脂肪肝和IR的發(fā)生發(fā)展均與兩條重要的炎性反應(yīng)通路相關(guān)［1－2］，一條通路是c-Jun氨基末端激酶(JNK)途徑，另一條炎性反應(yīng)通路是 I kappa B 激酶 α/β(IKK-α/β)-核因子 κB(NF-κB)途徑，目前關(guān)于脂肪肝發(fā)生早期炎性反應(yīng)通路的改變的相關(guān)研究尚少。既往的研究表明，短期高脂喂養(yǎng)后即可誘導(dǎo)嚙齒類動物發(fā)生肝內(nèi)脂質(zhì)沉積［3］，本實(shí)驗(yàn)通過3 d高脂喂養(yǎng)誘導(dǎo)小鼠肝臟脂質(zhì)沉積，檢測高脂飲食誘導(dǎo)脂肪肝出現(xiàn)早期時肝胰島素敏感性和炎性反應(yīng)通路的變化，從而探討高脂喂養(yǎng)誘導(dǎo)脂肪肝的發(fā)生機(jī)制及其與肝IR的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物:清潔級雄性C57BL/J6小鼠(體質(zhì)量25～27 g)(北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號0225653)分為對照組及高脂組。對照組進(jìn)食普通飼料;高脂組脂類占總熱量59%，其中脂類主要由豬油(主要成分為棕櫚酸)提供;2組每日進(jìn)食熱量基本相等，喂養(yǎng)3 d后行相關(guān)指標(biāo)測定并處死小鼠，留取組織。

1.1.2 試劑:兔抗鼠 p-Akt、t-Akt、p-GSK-3α/β、t-GSK-3α/β、 p-JNK (Thr183/Tyr185)、 t-JNK、p-IKKα/β、IKKα/β 和 NF-κB 抗體(Cell Signaling公司)，內(nèi)參抗體Pan14-3-3(ABCAM公司)。

1.2 檢測指標(biāo)及方法

1.2.1 血液學(xué)指標(biāo)檢測:空腹血糖(FBG)用葡萄糖氧化酶法測定，血三酰甘油(TG)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶在全自動生化分析儀(Beckman X20)測定。

1.2.2 肝臟TG測定:取肝臟組織30 mg經(jīng)氯仿/甲醇抽提TG后，加入0.6%氯化鈉分離水相和有機(jī)相，吸取有機(jī)相待干燥后溶于100%乙醇500 μL，應(yīng)用GPO-PAP試劑盒測定TG含量(Boehringer Mannheim，Mannheim Germany)。1.2.3 肝胰島素敏感性評估:于喂養(yǎng)3 d后每組隨機(jī)取12只小鼠，禁食10 h過夜，每組小鼠隨機(jī)選取6只小鼠注射0.9%氯化鈉注射液，另向6只小鼠腹腔內(nèi)注射含有葡萄糖(3 g/kg BW)、胰島素(2 U/kg．BW)的混合溶液，于注射后40 min處死小鼠，其后留取肝臟組織，凍存于－70℃［4］。應(yīng)用本研究1.2.4所述Western blot方法測定前述胰島素葡萄糖混合溶液注射后40 min小鼠肝臟組織的兩個重要胰島素信號傳導(dǎo)因子Akt和GSK-3α/β總蛋白和磷酸化蛋白的表達(dá)。通過比較各組注射與未注射胰島素溶液的小鼠 p-Akt/t-Akt和 p-GSK-3α/β/t-GSK-3α/β表達(dá)變化評估胰島素敏感性，比值減少代表肝細(xì)胞內(nèi)胰島素信號傳導(dǎo)通路蛋白 Akt和GSK-3α/β的磷酸化減少，提示肝臟胰島素敏感性下降。

1.2.4 Western blot方法檢測蛋白表達(dá):肝臟組織勻漿中加入10倍裂解液，13 000 r/min離心15 min，取上清用BCA法測蛋白含量。取25 μg蛋白進(jìn)行9%聚丙烯凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉室溫封閉45 min后，加入1∶1 000稀釋的抗體，室溫孵育2 h，TTBS緩沖液洗膜后加入1∶10 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體，室溫孵育1 h，最后用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測，經(jīng)X膠片曝光顯影。用IMAGEJ軟件分析，其中NF-κB以目的蛋白的吸光度值除以內(nèi)參Pan14-3-3的吸光度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對含量。每組選6例樣本進(jìn)行蛋白表達(dá)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

在SPSS11.0軟件上進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 喂養(yǎng)3 d后兩組小鼠指標(biāo)檢測結(jié)果

高脂組小鼠肝臟TG水平顯著高于對照組(P＜0.01)(表1)。

表1 兩組小鼠喂養(yǎng)3 d后的資料Table 1 Comparison of parameters in 2 groups after 3-day feeding

表1 兩組小鼠喂養(yǎng)3 d后的資料Table 1 Comparison of parameters in 2 groups after 3-day feeding

＊P ＜ 0.01 compared with control．

group n body weight(g) FBG(mmol/L)plasma TG(mmol/L)serum ALT(IU/L) liver weight(g) liver TG content(μmol/g)control 20 26.0±0.2 6.1±0.2 1.09±0.02 36.2±3.8 0.99±0.08 11.03±0.29 HF 19 26.2±0.3 6.2±0.3 1.11±0.04 36.4±5.1 1.02±0.19 24.92±2.98*

2.2 肝臟胰島素敏感性評估

胰島素注射40 min后，高脂組 p-Akt/t-Akt和p-GSK-3α/β/t-GSK-3α/β 的比值顯著少于對照組(P ＜0.01)(圖1，表2)。

圖1 胰島素刺激后小鼠肝臟Akt和GSK-3α/β的磷酸化變化Fig 1 The change in phosphorylation of Akt and GSK-3 α/β in mice liver after insulin stimulation

表2 胰島素刺激后小鼠肝臟p-Akt/t-Akt和p-GSK3 β/t-GSK3β蛋白表達(dá)Table 2 Semi-quantitative data of protein expressions of p-Akt/t-Akt and p-GSK3β/t-GSK3β in liver after insulin stimulation，n=6)

表2 胰島素刺激后小鼠肝臟p-Akt/t-Akt和p-GSK3 β/t-GSK3β蛋白表達(dá)Table 2 Semi-quantitative data of protein expressions of p-Akt/t-Akt and p-GSK3β/t-GSK3β in liver after insulin stimulation，n=6)

＊P ＜0.01 compared with control;Data were represented as fold change．

group p-Akt/t-Akt p-GSK3β/t-GSK3β control 1.00±0.16 1.00±0.20 HF 0.34±0.06* 0.31±0.07*

2.3 小鼠肝臟炎性反應(yīng)通路標(biāo)志物蛋白表達(dá)變化

高脂組小鼠肝臟的磷酸化JNK顯著高于對照組(p-JNK/tJNK)(P ＜0.01)(圖2，表3)。

3 討論

圖2 兩組小鼠肝臟兩條炎性反應(yīng)通路標(biāo)志物蛋白表達(dá)變化Fig 2 Protein expression changes in markers of two inflammatory pathways in liver in 2 groups

表3 兩組小鼠肝臟兩條炎性反應(yīng)通路標(biāo)志物蛋白表達(dá)變化Table 3 Semi-quantitative data of protein expressions in markers of two inflammatory pathways in liver in 2 groups，n=6)

表3 兩組小鼠肝臟兩條炎性反應(yīng)通路標(biāo)志物蛋白表達(dá)變化Table 3 Semi-quantitative data of protein expressions in markers of two inflammatory pathways in liver in 2 groups，n=6)

*P ＜0.01 compared with control;Data were represented as fold change．

group p-JNK/t-JNK p-IKKα/β/t-IKKα/β NF-κB/Pan14-3-3 1.05±0.13 1.02±0.12 control 1.00±0.11 1.00±0.18 1.00±0.16 HF 1.59±0.13*

研究表明，NAFLD的發(fā)生發(fā)展和 IR密切相關(guān)［5］。本研究首先證明了3 d高脂喂養(yǎng)即可引起小鼠肝臟脂質(zhì)沉積，表明肝臟對外源脂質(zhì)過量攝入具有非常迅速的反應(yīng)。造模成功后，進(jìn)一步評價了高脂喂養(yǎng)小鼠肝臟的胰島素敏感性。本研究選用胰島素信號通路中的蛋白激酶B(PKB/亦稱為Akt)和糖原合成激酶-3α/β(GSK-3α/β)作為評價小鼠肝臟胰島素敏感性的指標(biāo)［6］，經(jīng)胰島素注射40 min后，高脂喂養(yǎng)小鼠的肝臟胰島素信號通路的下游因子Akt和GSK-3α/β的磷酸化蛋白表達(dá)較對照組顯著降低，提示3 d高脂喂養(yǎng)小鼠出現(xiàn)了肝臟IR。肝TG沉積與肝臟IR并行出現(xiàn)，提示脂肪肝和肝IR密切相關(guān)。

兩條主要炎性反應(yīng)通路的標(biāo)志物——JNK途徑(磷酸化-JNK/總 JNK)和 IKKα/β-NF-κB(磷酸化-IKKα/β/總 IKKα/β，總-IκBα)途徑均與 NAFLD 和IR的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。JNK通路在IR的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮核心的介導(dǎo)作用，通過對IRS-1和IRS-2的絲氨酸磷酸化抑制胰島素信號傳導(dǎo)［7］;JNK通路也被證明與NAFLD的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［7－9］，研究表明JNK介導(dǎo)了慢性高脂喂養(yǎng)小鼠脂肪肝的發(fā)展［10］，但是尚缺乏脂肪肝發(fā)生早期JNK通路變化的研究，本研究提示高脂喂養(yǎng)3d誘導(dǎo)的小鼠肝內(nèi)p-JNK蛋白表達(dá)增加，提示JNK通路激活介導(dǎo)了高脂喂養(yǎng)誘導(dǎo)的脂肪肝和肝IR早期的發(fā)生發(fā)展。

IKK-α/β-NF-κB 途徑是另一個非常重要的介導(dǎo)IR和脂肪肝發(fā)生發(fā)展的途徑［11］。慢性高脂喂養(yǎng)小鼠出現(xiàn)脂肪肝的同時，IKK-α/β和 NF-κB激活，NF-κB炎性反應(yīng)通路的特異性抑制可改善脂肪肝［12－13］。本研究提示，高脂喂養(yǎng)3 d后，小鼠肝臟內(nèi)NF-κB通路未激活，提示此通路沒有介導(dǎo)高脂飲食誘導(dǎo)的 NAFLD和 IR的早期發(fā)生，而可能是在NAFLD進(jìn)展的過程中發(fā)生并促進(jìn)了其進(jìn)一步的病理生理改變。

綜上所述，高脂飲食喂養(yǎng)3 d即可誘導(dǎo)小鼠肝臟脂質(zhì)沉積和肝IR，并伴有JNK通路激活，提示JNK通路介導(dǎo)了短期高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪肝和肝IR的發(fā)生，具體機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。

［1］Hotamisligil GS．Inflammation and metabolic disorders［J］．Nature，2006，444:860－867．

［2］Kodama Y，Brenner DA．c-Jun N-terminal kinase signaling in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease:Multiple roles in multiple steps［J］．Hepatology，2009，49:6 －8．

［3］ Moore JB．Non-alcoholic fatty liver disease:the hepatic consequence of obesity and the metabolic syndrome［J］．Proc Nutr Soc，2010，69:211 －220．

［4］Ozcan U，Yilmaz E，Ozcan L，et al．Chemical chaperones reduce ER stress and restore glucose homeostasis in a mouse model of type 2 diabetes［J］．Science，2006，313:1137 －1140．

［5］Day CP，James OF．Steatohepatitis:a tale of two“hits”?［J］．Gastroenterology，1998，114:842 －845．

［6］Leng S，Zhang W，Zheng Y，et al．Glycogen synthase kinase 3 beta mediates high glucose-induced ubiquitination and proteasome degradation of insulin receptor substrate 1［J］．J Endocrinol，2010，206:171 －181．

［7］Hirosumi J，Tuncman G，Chang L，et al．A central role for JNK in obesity and insulin resistance［J］．Nature，2002，420:333－336．

［8］Kodama Y，Brenner DA．c-Jun N-terminal kinase signaling in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease:Multiple roles in multiple steps［J］．Hepatology，2009，49:6－8．

［9］Tilg H，Moschen AR．Inflammatory mechanisms in the regulation of insulin resistance［J］．Mol Med，2008，14:222－231．

［10］Schattenberg JM，Singh R，Wang Y，et al．JNK1 but not JNK2 promotes the development of steatohepatitis in mice［J］．Hepatology，2006，43:163－172．

［11］Luedde T，Schwabe RF．NF-kappaB in the liver-linking injury，fibrosis and hepatocellular carcinoma［J］．Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2011，8:108 －118．

［12］Cai D，Yuan M，F(xiàn)rantz DF，et al．Local and systemic insulin resistance resulting from hepatic activation of IKK-beta and NF-kappaB［J］．Nat Med，2005，11:183 －190．

［13］Boden G，She P，Mozzoli M，et al．Free fatty acids produce insulin resistance and activate the proinflammatory nuclear factor-kappaB pathway in rat liver［J］．Diabetes，2005，54:3458－3465．