肖維威，周琳華，鄭文嶺，馬文麗

(南方醫(yī)科大學(xué)基因工程研究所，廣東廣州510515)

隨著生物醫(yī)藥科學(xué)的迅猛發(fā)展，檢測(cè)技術(shù)越來(lái)越受到重視。核酸擴(kuò)增是生命科學(xué)中最重要的檢測(cè)手段之一，目前已廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)診斷和傳染病病原體檢測(cè)等領(lǐng)域。核酸擴(kuò)增技術(shù)主要分為以常規(guī)PCR為基礎(chǔ)的變溫?cái)U(kuò)增技術(shù)以及恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)兩大類。常規(guī)PCR包括單一PCR、多重PCR、巢式PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等，恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)包括核酸序列依賴擴(kuò)增(nucleic acid sequence-based amplification，NABSA)、滾環(huán)DNA擴(kuò)增(rolling circle DNA amplification，RCA)、指數(shù)式擴(kuò)增反應(yīng)(exponential amplification reaction，EXPAR)、連接酶鏈擴(kuò)增反應(yīng)(ligase chain reaction，LCR)、鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)(strand displacement amplification，SDA)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)等。因PCR的變溫過(guò)程使其對(duì)儀器精密度要求較高，操作時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，從而導(dǎo)致PCR無(wú)法推廣至基層。因此，恒溫?cái)U(kuò)增成為核酸擴(kuò)增技術(shù)的一個(gè)研究熱點(diǎn)，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)就是其中一種。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)又稱為環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，是由Notomi等［1］于2000年開(kāi)發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法。憑借其高效、快速、特異、低廉、易檢測(cè)、易操作等特點(diǎn)，從問(wèn)世以來(lái)，短短十幾年，即在各種病原體、病毒快速檢測(cè)、動(dòng)植物檢疫等方面嶄露頭角，尤其在傳染性疾病診斷中發(fā)揮了極大作用。隨著該技術(shù)體系的完善與發(fā)展，其在分子檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用也必將越來(lái)越廣泛與深入。

1 LAMP技術(shù)的原理

1.1 LAMP的技術(shù)原理

LAMP技術(shù)針對(duì)靶序列的6個(gè)特異性區(qū)域設(shè)計(jì)2對(duì)引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等溫條件(65℃左右)保溫30～60 min，即可擴(kuò)增出109拷貝靶序列，并且伴有肉眼可見(jiàn)的副產(chǎn)物白色焦磷酸鎂沉淀產(chǎn)生。

1.2 引物組成

LAMP的2對(duì)引物分別稱為FIP、BIP、F3和B3，可識(shí)別靶基因的6個(gè)不同區(qū)域。F3:上游外部引物，由F3區(qū)組成，并與靶基因的F3c區(qū)域互補(bǔ)。B3:下游外部引物，由B3區(qū)域組成，和靶基因的B3c區(qū)域互補(bǔ)。FIP:上游內(nèi)部引物，由F2區(qū)和F1c區(qū)域組成，F(xiàn)2區(qū)與靶基因3'端的F2c區(qū)域互補(bǔ)，F(xiàn)1c區(qū)與靶基因5'端的Flc區(qū)域序列相同，兩者之間以TTTT連接。BIP:下游內(nèi)部引物，由B1c和B2區(qū)域組成，B2區(qū)與靶基因3'端的B2c區(qū)域互補(bǔ)，B1c區(qū)域與靶基因5'端的Blc區(qū)域序列相同，兩者之間以TTTT連接(圖1)。

1.3 引物設(shè)計(jì)原則

由于LAMP是通過(guò)2對(duì)引物與6個(gè)不同區(qū)域的相互識(shí)別來(lái)產(chǎn)生擴(kuò)增效應(yīng)，因此引物設(shè)計(jì)要求比較高。LAMP引物設(shè)計(jì)一般選取一段長(zhǎng)約130～200 bp(最長(zhǎng)300 bp，不可超過(guò)500 bp)的保守序列作為靶序列。引物設(shè)計(jì)需要遵循以下原則:1)要保持引物的退火溫度約55～66℃，其中F1c和B1c的Tm值最高(64～66℃)，F(xiàn)2和B2次之(59～61℃)，F(xiàn)3和B3最低(55～60℃);GC含量高者，取Tm范圍較高值;而AT含量高者，取Tm范圍較低值。2)B1c、F2和F3與靶保守序列(5'→3'方向)的相應(yīng)部分相同，F(xiàn)1c、B2和B3與靶保守序列的相應(yīng)部分反向互補(bǔ)。3)F2的前端與B2之間相距120～180 bp，F(xiàn)2的前端與F3及B2的前端與B3之間相距0～20 bp，F(xiàn)2的前端與F1c及B2的前端與B1c之間相距40～60 bp。4)避免引物二級(jí)結(jié)構(gòu)形成，特別是3'端不應(yīng)存在富AT區(qū)，不能與其他引物互補(bǔ)。5)GC含量在40% ～65%之間，以50% ～60%為最佳。

具體設(shè)計(jì)時(shí)，采用在線LAMP引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer 3.0(或4.0)http://primerexplorer.jp/e，并結(jié)合DNAstar的MegAlign模塊和Primer 5.0對(duì)引物進(jìn)行綜合比較，防止產(chǎn)生引物二聚體。還可以利用在線BLAST，將設(shè)計(jì)好的引物在Gen-Bank中進(jìn)行比對(duì)確認(rèn)，以保證引物的特異性。

2 LAMP技術(shù)的特點(diǎn)

LAMP之所以被很多科學(xué)家認(rèn)為可以替代PCR技術(shù)在于其有幾大突出特點(diǎn):

2.1 高效性

LAMP反應(yīng)不需要雙鏈DNA的預(yù)熱變性，避免了溫度循環(huán)造成的時(shí)間損失。核酸擴(kuò)增一般在1 h內(nèi)均可完成。在穩(wěn)定的體系中添加環(huán)引物后，時(shí)間更可以縮短到原來(lái)的1/2，多數(shù)情況在20～30 min即有擴(kuò)增產(chǎn)物可被檢測(cè)。這對(duì)于快速診斷十分重要，便于患者即時(shí)獲得臨床檢驗(yàn)結(jié)果，醫(yī)生及時(shí)決定治療方案。

圖1 LAMP引物設(shè)計(jì)示意圖Fig 1 The schematic diagram of LAMP primers

2.2 高靈敏性

與定性PCR相比，LAMP法的檢測(cè)率要比其高出1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，具有real-time TaqMan PCR同樣的敏感性，能滿足低拷貝數(shù)樣品的檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物靶序列可達(dá)到109以上。有研究［2］發(fā)現(xiàn)，加環(huán)引物的敏感性要比沒(méi)有加環(huán)引物的高出7個(gè)數(shù)量級(jí)，在極低模板量(0.01 PFU)即可獲得結(jié)果。

2.3 高特異性

由于是針對(duì)靶序列6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異性引物，6個(gè)區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配均不能進(jìn)行核酸擴(kuò)增，故其特異性極高。

2.4 操作簡(jiǎn)單

擴(kuò)增結(jié)果判定不需要對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行電泳，而可直接用肉眼觀察擴(kuò)增管濁度，或通過(guò)向其擴(kuò)增產(chǎn)物中添加熒光染料再通過(guò)顏色變化來(lái)判定結(jié)果，使結(jié)果可視化，操作更簡(jiǎn)單。

2.5 成本低廉

LAMP核酸擴(kuò)增是在等溫條件下進(jìn)行，只需要恒溫水浴鍋即可，不需要特殊的試劑及儀器，適合大規(guī)模篩檢和基層疾病檢測(cè)。

3 LAMP法的進(jìn)展

鑒于LAMP技術(shù)相比于其他核酸擴(kuò)增方法具有以上多種優(yōu)點(diǎn)，人們?cè)谠S多方面對(duì)其更進(jìn)行了改進(jìn)和研究，使其更加簡(jiǎn)便快速，以便更適于臨床檢測(cè)的要求。LAMP法的進(jìn)展主要包括:

3.1 檢測(cè)模板的拓展

除對(duì)DNA檢測(cè)外，LAMP也可對(duì)RNA分子進(jìn)行檢測(cè)。RT-LAMP的擴(kuò)增原理與LAMP相同，只是在反應(yīng)體系中增加了反轉(zhuǎn)錄試劑，使RNA的反轉(zhuǎn)錄和LAMP擴(kuò)增在同一試管中完成，而不需要分步進(jìn)行［3－5］。2008 年，Kelly 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，LAMP 法對(duì)模板要求不高，可直接用于某些病原微生物樣本的檢測(cè)，而無(wú)需對(duì)樣本中的核酸進(jìn)行提取純化，這使LAMP技術(shù)在臨床應(yīng)用中更加簡(jiǎn)便［7］。

3.2 反應(yīng)速度改進(jìn)

LAMP是恒溫?cái)U(kuò)增，沒(méi)有溫度變化的時(shí)間損耗，一般60～90 min即可完成擴(kuò)增反應(yīng)，能基本滿足臨床病原微生物快速檢測(cè)的要求，但相比臨床常用的ELISA等免疫學(xué)技術(shù)，所需時(shí)間還是較長(zhǎng)，因此人們進(jìn)行了加快反應(yīng)速度的研究。2005年，Yoshida等［2］通過(guò)在反應(yīng)體系中添加2條環(huán)引物的方法使反應(yīng)速度大大提高，反應(yīng)時(shí)間縮短一半，在30 min內(nèi)即可完成反應(yīng)。

3.3 產(chǎn)物鑒定方法

對(duì)于LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)通常有3種方法:1)經(jīng)瓊脂糖電泳，EB染色觀察梯度條帶。LAMP反應(yīng)中的產(chǎn)物是一系列具有不同莖長(zhǎng)度的莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA和帶有許多環(huán)的類似花椰菜結(jié)構(gòu)的DNA混合物，因此當(dāng)用凝膠電泳分析時(shí)，會(huì)產(chǎn)生特異的梯狀條帶。2)肉眼觀察。在產(chǎn)物中加入SYBR GreenⅠ，變成綠色說(shuō)明有擴(kuò)增產(chǎn)物，沒(méi)有變色說(shuō)明無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物。3)間接通過(guò)對(duì)LAMP擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀形成的渾濁程度進(jìn)行判斷。目前，這種方法已被改進(jìn)并成功開(kāi)發(fā)出一種實(shí)時(shí)濁度檢測(cè)儀［8］，它也可以用于對(duì)靶序列進(jìn)行定量分析。

3.4 與其他技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用

LAMP技術(shù)在建立之后，人們利用其敏感、簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)，將其與其他的技術(shù)進(jìn)行聯(lián)合，開(kāi)發(fā)了很多有效的檢測(cè)方法。2004年，Hataoka等［9］將LAMP法與電泳結(jié)合，制成聚丙烯酰胺凝膠基因芯片，用來(lái)檢測(cè)和分析特異性基因類型。2003年，Maruyama等［10］把LAMP和原位雜交相結(jié)合，建立原位LAMP(in-situ LAMP)，用于檢測(cè)組織細(xì)胞中大腸桿菌O157∶H7。2006年申建維等［11］在檢測(cè)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌時(shí)，將核酸雜交和LAMP技術(shù)進(jìn)行結(jié)合，用多重LAMP同時(shí)擴(kuò)增金黃色葡萄球菌耐藥基因mecA和femA。結(jié)果該方法的最低檢測(cè)限為10 CFU/mL，與藥敏試驗(yàn)結(jié)果相比較，靈敏度為99.0%，特異性為90.9%，證明該方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便快速，適用于臨床病原微生物的快速檢測(cè)。

4 LAMP在病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

4.1 細(xì)菌的檢測(cè)

首先將LAMP用于細(xì)菌檢測(cè)的是Maruyama等［10］，他們用該技術(shù)成功檢測(cè)了大腸桿菌O157∶H7細(xì)胞中stxA2基因。Maed等［12］針對(duì)引起牙齦炎的病原菌16S rRNA基因建立了LAMP技術(shù)，可在30 min內(nèi)檢測(cè)出含有20個(gè)細(xì)菌的擴(kuò)增子，產(chǎn)物不需要進(jìn)行電泳，只要向擴(kuò)增產(chǎn)物中添加熒光染料SYBY GreenⅠ，通過(guò)肉眼觀察直接判定結(jié)果，是一種診斷口腔傳染性疾病的有效快速診斷方法。朱杰儀等［13］根據(jù)不同血清型副豬嗜血桿菌的16S rRNA高度保守區(qū)域，建立了LAMP檢測(cè)方法，反應(yīng)可在1 h內(nèi)完成，比PCR敏感100倍。目前LAMP還成功地用于特異檢測(cè)炭疽芽孢桿菌［7］、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌［11］、霍亂弧菌［14］、肺炎鏈球菌［15］等細(xì)菌類病原微生物。通過(guò)對(duì)眾多細(xì)菌研究結(jié)果表明，與傳統(tǒng)PCR相比，LAMP技術(shù)不僅快速、敏感，而且具有良好的特異性。

4.2 病毒的檢測(cè)

Enomoto等［16］及 Kaneko 等［17］采用 LAMP 方法擴(kuò)增7型人類皰疹病毒(HHV-7)DNA，并采用焦磷酸鎂濁度法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果反應(yīng)30 min后LAMP的檢測(cè)靈敏性為每管500拷貝，60 min的靈敏性為每管250拷貝，而HHV-6A、HHV-6B和巨細(xì)胞病毒(HCMV)均未出現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)。自用LAMP成功地檢測(cè)了人類皰疹病毒之后，又用LAMP對(duì)單純皰疹病毒［18］、水痘帶狀皰疹病毒［19］、乙肝病毒［20］實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)。

在同一反應(yīng)管中加入反轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶，還可以對(duì)RNA病毒進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增檢測(cè)。2009年Hosaka等［21］利用RT-LAMP對(duì)HIV-1M組進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增反應(yīng)在35 min內(nèi)即可完成，檢測(cè)限達(dá)到120拷貝/mL。從57名感染HIV-1的患者和40名未感染HIV-1的居民體內(nèi)收集血漿樣品進(jìn)行RT-LAMP分析，結(jié)果與預(yù)期完全一致。由此可見(jiàn)，RT-LAMP分析在HIV診斷上快速靈敏，尤其適用于資源條件不足的環(huán)境。此外，對(duì)狂犬病病毒［22］、日本乙型腦炎病毒［23］、馬爾堡病毒［24］、禽流感病毒［25］等進(jìn)行 RT-LAMP 檢測(cè)的方法也已建立起來(lái)，并得到不斷深入的研究。

4.3 寄生蟲(chóng)的檢測(cè)

原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)是人類重要而常見(jiàn)的病原體，嚴(yán)重危害人類健康?；贚AMP技術(shù)的特點(diǎn)，其在原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)檢測(cè)方面也得到了廣泛應(yīng)用。2012年易海華等［26］針對(duì)感染人的4種瘧原蟲(chóng)(惡性瘧原蟲(chóng)、三日瘧原蟲(chóng)、卵形瘧原蟲(chóng)、間日瘧原蟲(chóng))的18S rRNA基因共有保守序列，建立了定量的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增基因檢測(cè)方法。該法可特異區(qū)分檢測(cè)上述4種瘧原蟲(chóng)與12種相關(guān)寄生蟲(chóng)，與PCR方法相比，LAMP檢測(cè)方法的敏感性是其10倍，檢出限達(dá)到1.42×101拷貝/μL，適合瘧疾防治檢測(cè)的需要。目前 LAMP 還廣泛地應(yīng)用于錐蟲(chóng)［27］、弓形蟲(chóng)［28］、血吸蟲(chóng)［29］等的檢測(cè)。

5 展望

目前LAMP技術(shù)的研究主要集中在產(chǎn)物檢測(cè)的方便性和反應(yīng)速度上，各國(guó)科技工作者都在努力提高反應(yīng)速度、縮短反應(yīng)時(shí)間、找到簡(jiǎn)便的產(chǎn)物檢測(cè)方法，以更好地應(yīng)用于基層臨床診斷和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。憑借其操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、可以在短時(shí)間內(nèi)快速獲得大量特異性擴(kuò)增產(chǎn)物、擴(kuò)增產(chǎn)物易判斷、不需要昂貴的儀器和試劑等優(yōu)點(diǎn)，LAMP技術(shù)非常適用于臨床即時(shí)、快速簡(jiǎn)便的大樣本量檢測(cè)要求，必將成為核酸研究領(lǐng)域的重要工具，在病原微生物檢測(cè)領(lǐng)域有著非常廣泛的應(yīng)用前景。

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