王學(xué)習(xí)， 路 莉， 李少海， 千維娜， 王 艷， 祁永福， 趙健雄

(1.蘭州大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所，甘肅蘭州 730000;2.蘭州大學(xué)藥理研究所，甘肅省新藥臨床前研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730000)

胃食管反流病 (Gastroesophageal reflux disease)是一種復(fù)發(fā)頻率很高的慢性難治性疾病，目前采用抑酸藥物、促胃動(dòng)力藥物等對(duì)癥治療，短期療效較好，但停藥后易復(fù)發(fā)，長(zhǎng)期用藥患者依從性較差［1］。疏肝和胃顆粒 (湯)(專利號(hào):200710017349.6)經(jīng)臨床驗(yàn)證，對(duì)反流性食管炎 (Reflux esophagitis)治療已取得肯定的臨床療效［2］，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，它可以降低反流性食管炎大鼠胃和食管pH值、改善食管炎性病理?yè)p傷、抑制黏膜增生［3］，其抗炎機(jī)制與調(diào)節(jié)人白介素23/人白介素17(IL-23/IL-17)炎癥軸［4］和叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子O4(FOXO4)信號(hào)通路［5］相關(guān)。為進(jìn)一步探討疏肝和胃顆粒對(duì)反流性食管炎大鼠的治療作用及機(jī)制，進(jìn)行其對(duì)胃平滑肌細(xì)胞收縮和胃腸激素水平影響的實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料

1.1 試驗(yàn)藥物 疏肝和胃顆粒(專利號(hào):200710017349.6)處方組成及比例:柴胡10份、白芍15份、枳殼10份、姜半夏10份、陳皮10份、烏賊骨15份、黃芩10份、郁金10份、木香5份、生甘草5份，委托蘭州佛慈制藥廠加工生產(chǎn)，制備工藝為藥材加8倍量水，浸泡1 h，提取3次，1 h/次，生產(chǎn)批號(hào):09-05-10，臨用前用生理鹽水配制成含生藥1.08 g/mL。

奧美拉唑膠囊，20mg/粒，魯南貝特制藥有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H19990317。

1.2 動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量 (220±20)g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(甘)2004-2006-0000449。

1.3 試劑 Ⅱ型膠原酶、大豆胰蛋白酶抑制劑，Sigma公司;胃泌素 (GAS)、胃動(dòng)素 (MTL)放免試劑盒，解放軍總醫(yī)院科技開(kāi)發(fā)中心放免所提供;血管活性腸肽 (VIP)放免試劑盒，北京華英放免技術(shù)研究所。

1.4 儀器 JEM100B型透射電鏡，美國(guó)BECTONDISCKINSON公司產(chǎn)品;CK—4032PH型倒置顯微鏡，日本OLYMPUS公司;全自動(dòng)放免測(cè)定儀，中國(guó)科技大學(xué)中佳公司。

1.5 方法

1.5.1 造模 健康SD大鼠，適應(yīng)性觀察1周，行半幽門(mén)結(jié)扎聯(lián)合賁門(mén)肌切開(kāi)術(shù)復(fù)制反流性食管炎模型［3］。另取動(dòng)物行假手術(shù)，即開(kāi)腹后不進(jìn)行任何手術(shù)操作關(guān)腹。所有動(dòng)物禁食48 h，再行觀察1周，剔除異常動(dòng)物。

1.5.2 含藥血清制備 取反流性食管炎模型大鼠分為模型組 (生理鹽水)、奧美拉唑組 (奧美拉唑，8.7 mg/kg)和疏肝和胃顆粒組 (疏肝和胃顆粒，10.8 g/kg)，每組動(dòng)物雌雄各半，所有動(dòng)物等體積灌胃給藥，每日2次，共3 d。于末次灌胃后2 h腹主動(dòng)脈采血，分離血清，同組動(dòng)物血清混合，0.22 μm微孔濾膜無(wú)菌過(guò)濾后，置－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 食管、胃平滑肌細(xì)胞的制備及細(xì)胞收縮反應(yīng)的測(cè)定 參考文獻(xiàn)方法制備游離的大鼠食管［6］、胃平滑肌細(xì)胞。取造模成功1周未治療反流性食管炎大鼠，實(shí)驗(yàn)前24 h禁食不禁水，剝?nèi)∈彻?、全胃，HEPEs緩沖液中分別取食管下括約肌 (胃賁門(mén)與食管相連處呈壺腹?fàn)钆虼笄茵つぴ龊瘛⒓±w維呈環(huán)形排列的節(jié)段)、胃體 (距賁門(mén)約0.5 cm)、胃竇 (距幽門(mén)約0.5 cm)和幽門(mén)4個(gè)部分，剪成1～2 mm3的小肌塊，31℃孵育消化2次，30 min/次，過(guò)濾，緩沖液洗。重懸肌塊于HEPEs緩沖液中，31℃振蕩30 min，500 μm尼龍網(wǎng)過(guò)濾，收集單個(gè)平滑肌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度1×105/mL。臺(tái)盼藍(lán)檢查細(xì)胞活性，實(shí)驗(yàn)要求成活細(xì)胞在90%以上。整個(gè)操作過(guò)程液體中均通O2。

取0.27 mL預(yù)熱細(xì)胞懸液，接種于24孔培養(yǎng)板，加入0.09 mL含藥血清，31℃孵育60 s，加入0.10 mL 2.5%戊二醛終止反應(yīng)。每組設(shè)10復(fù)孔。每個(gè)樣本倒置顯微鏡下隨機(jī)測(cè)量20個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)軸作為該樣本細(xì)胞長(zhǎng)度。細(xì)胞的收縮反應(yīng)是平滑肌細(xì)胞長(zhǎng)度在加入藥物或含藥血清后出現(xiàn)縮小的現(xiàn)象，可以用縮小多少微米表示或者以給予藥物或含藥血清前后細(xì)胞縮小變化的百分?jǐn)?shù)來(lái)表示。細(xì)胞收縮變化百分?jǐn)?shù)=［(對(duì)照組細(xì)胞平均長(zhǎng)度值－給藥組細(xì)胞平均長(zhǎng)度值)/對(duì)照組細(xì)胞平均長(zhǎng)度值］×100%

1.5.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組與給藥 造模動(dòng)物隨機(jī)分為模型組(生理鹽水)、奧美拉唑組 (奧美拉唑，8.7 mg/kg)、疏肝和胃顆粒組 (疏肝和胃顆粒，10.8 g/kg)，假手術(shù)動(dòng)物設(shè)為假手術(shù)對(duì)照組 (生理鹽水)，另取正常動(dòng)物作為正常對(duì)照組 (生理鹽水)，每組10只。所有動(dòng)物等體積灌胃給藥，2 mL/200 g，1次/d，連續(xù)28 d。

1.5.5 標(biāo)本采集 治療結(jié)束后，動(dòng)物腹主動(dòng)脈取血，分裝于2個(gè)一次性塑料試管內(nèi)，一份標(biāo)本2 mL用于分離血清，余注入含10%EDTA-Na2及抑肽酶的4℃預(yù)冷試管內(nèi)分離血漿備用。取1 mL血漿加入4℃預(yù)冷丙酮2 mL，混勻，1 500×g低溫離心15 min，取上清液，揮干丙酮后低溫冷凍干燥，用于VIP檢測(cè)。

采血后處死動(dòng)物，剝?nèi)∈彻?，肉眼大體觀察黏膜損傷情況，后將食管分為2份，分別用4%甲醛和3%戊二醛固定。

1.5.6 大鼠食管黏膜組織病理學(xué)觀察 取甲醛固定食管組織，常規(guī)切片HE染色，光鏡下觀察食管組織病理學(xué)改變，包括食管組織鱗狀上皮增生和黏膜固有層中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況等。

取戊二醛固定食管組織，制作切片，在電鏡下觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，主要包括上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)、胞質(zhì)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)、細(xì)胞之間橋粒連接結(jié)構(gòu)及細(xì)胞間隙等。

1.5.7 胃腸激素水平檢測(cè) 取分離備用血清，放免法檢測(cè)GAS水平;取分離備用血漿，放免法檢測(cè)MTL;取經(jīng)丙酮處理血漿凍干品放免法檢測(cè)VIP檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 含藥血清對(duì)胃食管平滑肌細(xì)胞收縮反應(yīng)的影響 疏肝和胃顆粒含藥血清孵育可以引起來(lái)源于食管下括約肌、胃體、胃竇和胃幽門(mén)部位平滑肌細(xì)胞收縮，引起平滑肌細(xì)胞長(zhǎng)軸長(zhǎng)度縮短，與正常對(duì)照組和奧美拉唑組比較，均有顯著性差異 (P＜0.05/0.01)。奧美拉唑含藥血清可引起食管下括約肌平滑肌細(xì)胞收縮，與正常對(duì)照組比較，有顯著性差異 (P＜0.01);但其對(duì)胃體、胃竇和胃幽門(mén)部位平滑肌細(xì)胞收縮無(wú)影響，與正常對(duì)照組比較，無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 含藥血清對(duì)食管和胃不同部位平滑肌細(xì)胞收縮變化的影響 (±s，n=10)

表1 含藥血清對(duì)食管和胃不同部位平滑肌細(xì)胞收縮變化的影響 (±s，n=10)

注:與正常對(duì)照組比較，＊＊P＜0.01;與奧美拉唑組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組別 劑量/(g·kg－1)收縮變化指數(shù)正常對(duì)照組 － 67.54±6.52 － 85.75±7.92 － 85.18±8.17 － 82.57食管下括約肌 胃體 胃竇 幽門(mén)細(xì)胞長(zhǎng)軸長(zhǎng)度/μm收縮變化指數(shù)細(xì)胞長(zhǎng)軸長(zhǎng)度/μm收縮變化指數(shù)細(xì)胞長(zhǎng)軸長(zhǎng)度/μm收縮變化指數(shù)細(xì)胞長(zhǎng)軸長(zhǎng)度/μm±8.99 －奧美拉唑組 0.008 7 58.91±6.11＊＊ 12.78 82.03±8.69 4.34 80.59±8.54 5.39 80.88±9.30 2.05疏肝和胃顆粒組 10.8 52.75±3.88＊＊▲ 21.90 69.05±6.66＊＊▲▲ 19.48 70.78±8.40＊＊▲ 16.90 70.07±8.67＊＊▲15.14

2.2 對(duì)反流性食管炎大鼠食管病理組織學(xué)的影響 大體觀察可見(jiàn)，正常對(duì)照組和假手術(shù)組動(dòng)物食管黏膜光滑完整，模型組大鼠食管黏膜均有呈點(diǎn)狀或條索狀等不同程度的發(fā)紅，甚或出現(xiàn)糜爛、潰瘍;奧美拉唑組、疏肝和胃顆粒組大鼠食管黏膜損傷程度介于上述二者之間。

光鏡下可見(jiàn)，正常對(duì)照組和假手術(shù)組動(dòng)物食管組織基本無(wú)炎性改變，上皮細(xì)胞層內(nèi)間或存在少量炎細(xì)胞;模型組大鼠食管組織鱗狀上皮增生，細(xì)胞層次增加，以基底細(xì)胞增生為主，黏膜固有層可見(jiàn)數(shù)量不等的中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn);奧美拉唑組、疏肝和胃顆粒組食管組織炎性改變減輕，鏡下可見(jiàn)鱗狀上皮輕度增生，黏膜固有層可見(jiàn)少量的中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞。

電鏡觀察可見(jiàn)，正常對(duì)照組和假手術(shù)組動(dòng)物可見(jiàn)正常食管黏膜上皮細(xì)胞，上皮細(xì)胞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)、上皮細(xì)胞之間間隙正常，細(xì)胞之間可見(jiàn)多個(gè)橋粒連接，未見(jiàn)橋粒連接及數(shù)量異常;模型組可見(jiàn)細(xì)胞之間間隙增寬，橋粒連接結(jié)構(gòu)明顯減少，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器腫脹;奧美拉唑組和疏肝和胃顆粒組上皮細(xì)胞及胞質(zhì)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)、細(xì)胞之間橋粒連接和細(xì)胞間隙基本恢復(fù)正常。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠食管黏膜超微結(jié)構(gòu)變化

2.3 對(duì)反流性食管炎大鼠血GAS、MTL和 VIP水平的影響 反流性食管炎大鼠模型血GAS水平下降，血MTL和VIP水平升高，與正常對(duì)照組比較，有顯著性差異 (P＜0.05/0.01)。對(duì)照藥物奧美拉唑可升高血GAS、MTL水平，降低血VIP水平，其中血GAS和VIP水平與模型組比較有顯著性差異 (P＜0.01);血MTL水平與正常對(duì)照組比較具有顯著性差異 (P＜0.01)，但與模型組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.0 5)，說(shuō)明奧美拉唑不升高反流性食管炎大鼠血MTL水平。疏肝和胃顆?？缮哐狦AS、MTL水平，降低血VIP水平，其中血GAS和VIP水平與模型組比較有顯著性差異 (P＜0.01);血MTL水平與模型組和正常對(duì)照組比較均有顯著性差異 (P＜0.05/0.01)。結(jié)果見(jiàn)表2。±s，n=10)

表2 對(duì)反流性食管炎大鼠血GAS、MTL和VIP水平的影響(

3 討論

反流性食管炎屬于祖國(guó)醫(yī)學(xué)“泛酸”、“反胃”、“噎膈”等范疇，胃失和降，胃氣上逆是本病的基本病機(jī)，肝胃郁熱，酸水泛溢為本病的發(fā)病關(guān)鍵，治療當(dāng)以疏肝理氣、和胃降逆、清泄熱濁以治其本，制酸止痛以治其標(biāo)。疏肝和胃顆粒方由柴胡、白芍、枳殼、姜半夏、陳皮、烏賊骨、黃芩、郁金、木香、生甘草十味藥組成，方中四逆散疏肝理脾，半夏、陳皮和胃降逆，黃芩配半夏辛開(kāi)苦降，木香、郁金行氣活血，烏賊骨制酸斂瘍，共奏疏肝理脾、制酸行氣、和胃降逆之功。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示疏肝和胃顆?？筛纳品戳餍允彻苎状笫笫彻莛つp傷，增加胃食管平滑肌細(xì)胞收縮力，調(diào)節(jié)血GAS、MTL和VIP水平。

反流性食管炎是酸相關(guān)性疾病，反流物進(jìn)入食管，酸損傷引起食管黏膜炎癥，超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為上皮細(xì)胞間隙增寬，并與食管酸反流的程度相關(guān)［7-10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示疏肝和胃顆粒可以改善模型大鼠食管組織光鏡下鱗狀上皮增生、細(xì)胞層次增加及黏膜固有層中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等組織學(xué)損傷，恢復(fù)電鏡下超微結(jié)構(gòu)食管上皮細(xì)胞間隙增寬、橋粒連接結(jié)構(gòu)減少及胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器腫脹等組織學(xué)改變，上述改變與疏肝和胃降逆顆?？蓽p少食管反流物和食管酸損傷有關(guān)［11-12］。

反流性食管炎又是胃腸道動(dòng)力相關(guān)性疾病。Biancani等［13］研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)時(shí)間酸損傷可影響食管下括約肌的靜息壓力，從而減弱對(duì)酸性物質(zhì)的清除能力。本研究行半幽門(mén)結(jié)扎聯(lián)合賁門(mén)肌切開(kāi)術(shù)復(fù)制反流性食管炎模型，引起大鼠食管胃內(nèi)容物反流和胃排空延遲，導(dǎo)致反流性食管炎的發(fā)生。疏肝和胃顆粒含藥血清孵育可引起食管下括約肌平滑肌細(xì)胞收縮增強(qiáng)，食管下括約肌的靜息壓升高，大鼠食管抗反流屏障功能改善，反流減少;同時(shí)，疏肝和胃顆粒含藥血清亦可引起胃體、胃竇和胃幽門(mén)部位平滑肌細(xì)胞收縮增強(qiáng)，增加胃蠕動(dòng)和排空能力，降低腹壓，減少食管反流的發(fā)生。

反流性食管炎的發(fā)病機(jī)制與食管下括約肌功能異常密切相關(guān)，在反流性食管炎患者中表現(xiàn)為調(diào)節(jié)食管下括約肌張力和胃腸道運(yùn)動(dòng)的GAS、MTL和VIP等的異常。GAS是由胃竇及十二指腸黏膜開(kāi)放型G細(xì)胞分泌，起到保護(hù)胃腸黏膜、增強(qiáng)胃腸黏膜保護(hù)因子和促進(jìn)胃腸道的分泌功能，同時(shí)可提高幽門(mén)泵的活動(dòng)，使幽門(mén)擴(kuò)張，因而對(duì)胃排空有重要的促進(jìn)作用［14］。MTL是由胃腸黏膜分泌的多肽，是公認(rèn)的啟動(dòng)胃腸收縮活動(dòng)的腦腸肽，對(duì)胃腸道自主運(yùn)動(dòng)和平滑肌肌電活動(dòng)有興奮作用，可提高胃腸道收縮力和張力，促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)和胃排空，起著“清道夫”作用［15］。VIP為腸神經(jīng)系統(tǒng)中的主要抑制性肽能神經(jīng)遞質(zhì)，能引起食管下括約肌松弛，食管下括約肌壓力與血漿中VIP含量呈負(fù)相關(guān)，VIP神經(jīng)元增加或功能增強(qiáng)，可導(dǎo)食管下括約肌運(yùn)動(dòng)功能障礙。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，疏肝和胃顆?？缮叻戳餍允彻苎状笫笱狦AS、MTL水平，降低血VIP水平，促進(jìn)胃腸平滑肌收縮，增加胃腸道的運(yùn)動(dòng)，這與本研究的離體實(shí)驗(yàn)疏肝和胃顆粒血清孵育可引起胃體、胃竇和胃幽門(mén)部位平滑肌細(xì)胞收縮的研究結(jié)論一致。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中模型組大鼠血MTL水平與正常對(duì)照組比較未降低反而升高，可能與造模方法有關(guān)，研究采用半幽門(mén)結(jié)扎聯(lián)合賁門(mén)肌切開(kāi)術(shù)復(fù)制反流性食管炎大鼠模型，手術(shù)造成大鼠食管反流和胃排空延遲，并非原發(fā)性胃腸動(dòng)力下降引起反流性食管炎。另外，奧美拉唑含藥血清可引起食管下括約肌平滑肌細(xì)胞收縮，但對(duì)胃體、胃竇和胃幽門(mén)部位平滑肌細(xì)胞收縮基本無(wú)影響，其差異原因不明，尚待進(jìn)一步研究。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，疏肝和胃顆?？赏ㄟ^(guò)改善反流性食管炎食管黏膜損傷，增加食管、胃食管平滑肌細(xì)胞收縮力，調(diào)節(jié)GAS、MTL和VIP水平起到治療反流性食管炎作用。

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