朱艷琴， 殷勤紅， 虞 泓， 曾文波， 趙方允

(1.昆明理工大學(xué)分析測(cè)試研究中心，云南昆明 650093;2.云南大學(xué)中草藥生物資源研究所云百草實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650093)

三七花是傳統(tǒng)名貴中藥五加科植物三七Panax Notoginseng(Burk)F.H.Chen的干燥花蕾。三七花中含有各種人參皂苷［1］、三七花苷元［2］等。三七花作為藥材已載入《云南中草藥選》，“甘涼，清熱平肝，降壓。治療高血壓，頭昏，目眩，耳鳴，急性咽喉炎”;同時(shí)《中華本草》記載三七花“性甘味涼。清熱生津，平肝降壓。主治津傷口渴，咽痛音啞，高血壓病”。三七花［3-4］僅作為民間用藥材，其藥用價(jià)值未被充分利用。文獻(xiàn)中尚未有同時(shí)測(cè)定三七花中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的研究，本實(shí)驗(yàn)建立同時(shí)測(cè)定三七花中3種皂苷的方法，為完善該藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 DIONEXP680液相色譜儀 (P680四元梯度混合泵、ASI—100自動(dòng)進(jìn)樣器、UVD170U四通道紫外檢測(cè)器、TCC—100柱溫箱、CHROMELEONTM色譜信息管理軟件);BP211D電子天平(德國Sartorius公司);D101型大孔樹脂 (天津樹脂廠)。

1.2 試藥 三七皂苷R1(批號(hào)110745-200415)、人參皂苷Rg1(批號(hào)110703-200726)、人參皂苷Rb1(批號(hào)110704-200420)對(duì)照品均由中國藥品生物制品檢定所提供;三氯甲烷、石油醚、乙醇、甲醇為分析純，乙腈為色譜純，水為重蒸水。

1.3 藥材 三七花于2009年8月采于云南省各地州，經(jīng)云南大學(xué)中草藥生物資源研究所云百草實(shí)驗(yàn)室虞泓教授鑒定為五加科植物三七Panax Notoginseng(Burk)F.H.Chen的干燥花蕾。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Hypersil ODS色譜柱 (4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動(dòng)相A相為乙腈，B相為水，梯度洗脫，0～10 min(25%A)，10～45 min(25% ～40%A)，45～60 min(40% ～55%A);檢測(cè)波長203 nm;體積流量1.0 mL/min;柱溫35℃;進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見圖1。

圖1 混合對(duì)照品 (A)、樣品 (B)HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)and sample(B)

2.2 對(duì)照品貯備液和對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1對(duì)照品適量，分別加甲醇制成質(zhì)量濃度為470 μg/mL三七皂苷R1對(duì)照品貯備液、810μg/mL人參皂苷Rg1、1 220 μg/mL人參皂苷 Rb1對(duì)照品貯備液。再精密吸取貯備液適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為 9.4 μg/mL 三七皂苷 R1、40.5 μg/mL人參皂苷 Rg1、610 μg/mL人參皂苷 Rb1的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品粉末，精密稱定1.0 g置索氏提取器中，加三氯甲烷100 mL，加熱回流4 h，棄去三氯甲烷液，藥渣揮去三氯甲烷，加甲醇100 mL，加熱回流4 h，提取液揮干，加水20 mL使溶解，加石油醚 (30～60℃)提取2次，每次20 mL，棄去醚液，水液通過D101型大孔樹脂柱 (內(nèi)徑1.5 cm，長15 cm)，以水100 mL洗脫，棄去水液。再用20%乙醇100 mL洗脫，棄去20%乙醇洗脫液，繼用80%乙醇150 mL洗脫，收集洗脫液140 mL，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍哭D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察 分別進(jìn)樣2、5、10、20、40 μL的上述混合對(duì)照品溶液，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量 (μg)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。三七皂苷R1的回歸方程為Y=3.236 8X+0.014 4，r=0.999 7，在0.018 8 ～0.376 μg范圍內(nèi)峰面積與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系;人參皂苷Rg1的回歸方程為Y=1.042 6X－0.009 2，r=0.999 7，在0.081～1.62 μg范圍內(nèi)峰面積與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系;人參皂苷 Rb1的回歸方程為Y=0.647 6X+0.011 2，r=0.999 9，在 1.22～24.4 μg范圍內(nèi)峰面積與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 分別吸取混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，RSD分別為三七皂苷R11.66%，人參皂苷Rg11.40%，人參皂苷Rb10.94%。表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定試實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液，照上述色譜條件，分別于0、2、4、6 h測(cè)定峰面積，RSD分別為三七皂苷R11.34%，人參皂苷Rg11.36%，人參皂苷Rb10.89%。表明樣品中3種成分在6 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 按供試品溶液制備方法項(xiàng)下操作，平行制備6份樣品，照上述色譜條件，分別測(cè)定3種成分，RSD分別為三七皂苷R11.41%，人參皂苷Rg11.23%，人參皂苷Rb10.63%。表明供試品溶液的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取三七皂苷R1對(duì)照品6.3 mg至100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，再分別精密量取10 mL至50 mL量瓶并用甲醇定容，作為三七皂苷R1加樣對(duì)照品溶液;精密稱取人參皂苷Rg1對(duì)照品9.1 mg至100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，再分別精密量取20 mL至50 mL量瓶并用甲醇定容，作為人參皂苷Rg1加樣對(duì)照品溶液;精密稱取人參皂苷Rb1對(duì)照品38.6 mg至50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為人參皂苷Rb1加樣對(duì)照品溶液。稱取已知含有量的硯山縣維摩鄉(xiāng)樣品6份各0.5 g，精密加入上述3種加樣對(duì)照品溶液各5 mL，按供試品溶液制備項(xiàng)下方法制成加樣回收供試液，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

2.9 樣品測(cè)定 精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液按上述色譜條件，注入液相色譜儀，記錄峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算樣品中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的量。結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)中參考《中國藥典》2010年版一部中三七［5］的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并參考相關(guān)文獻(xiàn)［6-14］，選擇乙腈-水為溶劑系統(tǒng)，并對(duì)梯度洗脫時(shí)間和比例進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，以滿足3種成分獲得較好的分離效果。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests

表2 三七花中3種皂苷的測(cè)定結(jié)果Tab.2 Determination of 3 ginsenosides in Notoginseng Flos

3.2 三七花中所含成分較多，并含有大量葉綠素，因此參照《中國藥典》2010年版一部中人參葉的樣品處理方法，選用D101型大孔吸附樹脂進(jìn)行洗脫，先用水洗去多糖，再用20%乙醇洗去黃酮類物質(zhì)，最后收集80%乙醇洗脫液，表明此法可起到較好的純化作用。

3.3 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采于云南各地的三七花藥材各成分之間略有差別，其中人參皂苷Rb1含有量差異不大，而三七皂苷R1和人參皂苷Rg1含有量差異較大，這可能與三七花藥材的產(chǎn)地、種植條件、采收期等有關(guān)。

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