廖 婉， 章津銘， 傅 舒， 王繼森， 傅超美*

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室，四川成都 611137;2.成都市食品藥品檢測中心，四川成都 610045)

醋莪術(shù)為姜科植物蓬莪術(shù)Curcuma phaeocaulisVal.，廣西莪術(shù)Curcuma kwangsiensisS.G.Lee et C.F.Liang和溫郁金Curcuma wenyujinY.H.Chen et C.Ling的干燥根莖醋制而成［1］，具有破血行氣、消積止痛的功效。醋莪術(shù)入肝經(jīng)血分，《本草綱目》云:“今人多以醋炒或煮熟入藥，取其引入血分也?！?《便讀》云: “嫌其峻厲，當(dāng)以醋炒用之”。故臨床常用醋莪術(shù)，既增強“破積消堅，去積聚癖塊”之效，又緩其峻猛藥性?，F(xiàn)有研究證明醋莪術(shù)具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、保肝等藥理作用［2］，其揮發(fā)油、姜黃素為其主要物質(zhì)基礎(chǔ)［3-4］。但大都忽略對醋莪術(shù)傳統(tǒng)功效及其物質(zhì)基礎(chǔ)的整體性探索，不利于莪術(shù)炮制機理的揭示。

本實驗在建立了莪術(shù)醋制工藝［5］、醋莪術(shù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［6］和進行了指紋圖譜研究的基礎(chǔ)上，擬以大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)改善作用表征醋莪術(shù)“破血”功效，考察了10個批次醋莪術(shù)對“氣滯血瘀證”模型血液流變學(xué)的影響，并采用灰色關(guān)聯(lián)度分析方法，旨在將指紋圖譜所代表的化學(xué)信息與藥效數(shù)據(jù)代表的生物效應(yīng)信息相關(guān)聯(lián)，通過譜效相關(guān)性研究尋找到醋莪術(shù)“破血”的有效物質(zhì)基礎(chǔ)，為莪術(shù)的醋制機理和質(zhì)量評價奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀 (Agilent 1200二極管陣列檢測器;四元泵在線脫氣系統(tǒng);Agilent 1200色譜工作站)(美國安捷倫科技有限公司);Mettler AE240十萬分之一電子分析天平(德國Mettler公司);FA1104萬分之一電子分析天平 (上海天平儀器廠);KQ3200型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。MDK全自動血液流變測試分析儀 (型號:MDK—3200AR);全自動血細胞分析儀 (型號:MEK—6318K)。

1.2 試藥 鹽酸腎上腺素注射液 (廣州白云山制藥有限公司，批號:100503);復(fù)方丹參片 (中山市恒生藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號:Z20103069)。

收集10個批次的生莪術(shù)飲片，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)標(biāo)本中心盧先明教授鑒定為姜科植物蓬莪術(shù)Curcuma phaeocaulisVal.的干燥根莖，參照文獻［5］制備得醋莪術(shù)飲片。

醋莪術(shù)水煎液的制備:取醋莪術(shù)飲片200 g，加水15倍，煎煮2次，每次1 h，趁熱濾過，合并煎液，60℃減壓濃縮至2 g/mL，貯存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

莪術(shù)醇對照品 (成都曼思特生物科技有限公司，批號:A0089，純度≥98%);莪術(shù)二酮對照品 (四川省維克奇生物科技有限公司，批號:201007，純度≥98%);吉馬酮對照品 (成都曼思特生物科技有限公司，批號:A0320，純度≥98%);甲醇為色譜純，水為重蒸水 (自制)，其它試劑均為分析純。

1.3 實驗動物 清潔級KM小鼠，購自四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，動物合格證號:SCXK(川)2008-15，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g。

2 方法與結(jié)果

2.1 醋莪術(shù)對“氣滯血瘀證”模型血液流變學(xué)的試驗研究

2.1.1 實驗方法［7］將大鼠隨機分6組 (樣本數(shù)為10)，即空白對照組 (等容積生理鹽水);模型對照組 (等容積生理鹽水);中藥陽性對照組 ［復(fù)方丹參片 (1.5 g/kg)］;醋莪術(shù)高劑量 (30 g/kg)、中劑量 (20 g/kg)、低劑量 (10 g/kg)組。藥效學(xué)實驗結(jié)果顯示醋莪術(shù)高劑量組 (30 g/kg)具有顯著性差異，故本實驗選用醋莪術(shù)高劑量組 (30 g/kg)進行驗證試驗，試驗方法如下:

除空白對照組外，各實驗組動物每日1次肌注氫化可的松10 mL/kg連續(xù)7 d，同時造模期間灌胃給予相應(yīng)藥物1.5 mL/200 g，1次/d。第8天給予空白組外的實驗大鼠皮下注射1次0.1%鹽酸腎上腺素0.1 mL。造模后禁食，次日灌胃給藥后2 h自股動脈取血，滴入含肝素鈉抗凝試管 (實驗前每只試管加入1 mmol/L肝素生理鹽水溶液0.2 mL，60℃烘干備用)，以測定全血黏度等指標(biāo)，另取20 μL抗凝全血備用以測血細胞壓積。

2.1.2 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計 實驗數(shù)據(jù)采用±s(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)表示，利用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理，多組間比較采用One-way ANOVA檢驗。

2.1.3 實驗結(jié)果 結(jié)果顯示，試驗中10批醋莪術(shù)在全血黏度 (高切)、血漿黏度、紅細胞聚集指數(shù)、血沉、血細胞壓積等方面，對“氣滯血瘀”型大鼠模型有顯著改善 (P＜0.05)。見表1。

表1 不同批次醋莪術(shù)高劑量組 (30 g/kg)對大鼠血液流變學(xué)影響結(jié)果 (±s，n=10)Tab.1 Results of hemorheology influenced by the stir-baked Curcumae Rhizoma with vinegar(±s，n=10)

表1 不同批次醋莪術(shù)高劑量組 (30 g/kg)對大鼠血液流變學(xué)影響結(jié)果 (±s，n=10)Tab.1 Results of hemorheology influenced by the stir-baked Curcumae Rhizoma with vinegar(±s，n=10)

注:與模型對照組相比，*P＜0.05。

批號 全血黏度/(mPa·s)血漿黏度/(mPa·s)聚集指數(shù) 血沉/(mm·h－1) 血細胞壓積/%紅細胞空白對照組 4.21±0.08* 1.36±0.05* 9.21±0.08* 1.36±0.06* 38.9±0.17*模型對照組 6.13±0.15 1.69±0.08 10.79±0.07 7.48±0.06 58.41±0.21陽性對照組 4.65±0.11* 1.42±0.12* 9.68±0.06* 3.74±0.07 44.42±0.18*100503 4.63±0.14* 1.53±0.11* 9.79±0.12* 5.16±0.11* 36.63±0.23*100921 5.12±0.18* 1.52±0.03* 9.92±0.14* 5.18±0.14* 38.33±0.26*101106 5.37±0.21* 1.47±0.06* 9.88±0.12* 5.04±0.05* 35.85±0.35*101012 4.86±0.15* 1.62±0.05* 9.99±0.16 5.11±0.07* 35.53±0.27*100517 4.58±0.22* 1.45±0.08* 9.94±0.12* 5.03±0.07* 33.95±0.31*100825 4.73±0.15* 1.58±0.05* 10.12±0.17 5.09±0.13* 34.87±0.27*100921 4.85±0.23* 1.48±0.05* 10.25±0.24 5.14±0.15* 38.42±0.22*101121 4.58±0.12* 1.44±0.07* 9.95±0.27* 5.23±0.08* 36.85±0.31*100915 4.78±0.16* 1.42±0.06* 9.98±0.16* 5.19±0.06* 35.53±0.24*100714 4.66±0.15* 1.53±0.04* 10.03±0.22 5.12±0.09* 35.48±0.21*

2.2 醋莪術(shù)HPLC指紋圖譜數(shù)據(jù)測定

2.2.1 色譜條件 Agilent Zorbax C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);DAD檢測器;檢測波長216 nm;色譜柱溫度35℃;體積流量1.0 mL/min;運行時間100 min;流動相為乙腈 (A)-水 (B)，梯度洗脫 (0～15 min，40% ～45%A;15～40 min，45% ～55%A;40～60 min，55% ～60%A;60～80 min，60% ～80%A;80～90 min，80% ～95%A)。

2.2.2 指紋圖譜檢測 醋莪術(shù)混合對照品及共有模式HPLC指紋圖譜見圖1、圖2。根據(jù)所建立的醋莪術(shù)指紋圖譜共有模式，確定了10批次醋莪術(shù)共形成了16個共有峰，將10個批次醋莪術(shù)飲片相應(yīng)保留時間的色譜峰面積進行整理，見表2。

圖1 混合對照品的HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprinting of reference substances

圖2 醋莪術(shù)HPLC指紋圖譜共有模式Fig.2 HPLC fingerprinting of common pattern of the stir-baked Curcumae Rhizoma with vinegar

2.3 醋莪術(shù)“譜-效”模型的建立 由于中藥指紋圖譜信息具有灰色性和模糊性，灰色關(guān)聯(lián)度是分析系統(tǒng)中各因素關(guān)聯(lián)程度的一種方法，是兩個系統(tǒng)或兩個因素間關(guān)聯(lián)性大小的量度，其基本思想是一種相對性的排序分析，是根據(jù)序列曲線幾何形狀的相似程度來判別其是否緊密。如果一組幾何曲線形狀越相似，則關(guān)聯(lián)度就越大，反之越小［8］。因此，本研究采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法［9］，以樣品藥效學(xué)指標(biāo)作為母序列，樣品指紋圖譜色譜峰信息作為子序列，依據(jù)母序列與子序列關(guān)聯(lián)度大小，可確定諸指紋特征對藥效貢獻的大小，由此從所考察的復(fù)雜系統(tǒng)中找出主次因素。

2.3.1 關(guān)聯(lián)系數(shù) 經(jīng)數(shù)據(jù)變換的母序列記為 {Xo(k)}，子序列記為 {Xi(k)}，則母序列與子序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)Loi(k)可由下式計算，關(guān)聯(lián)系數(shù)反映了兩個被比較序列的靠近程度:

其中，Δoi(k)=∣Xo(k) －Xi(k)∣ (1≤i≤m);Δmin和Δmax分別表示所有比較序列絕對差中的最小值和最大值;ρ為分辨系數(shù)，即是為了削弱最大絕對差數(shù)值太大引起的失真，提高關(guān)聯(lián)系數(shù)之間的差異顯著性，一般為0～1之間，本研究取為0.8。

表2 10批次醋莪術(shù)16個HPLC共有峰的峰面積數(shù)據(jù)Tab.2 Results of 16 common peaks of fingerprint of the stir-baked Curcumae Rhizomd with vinegar

2.3.2 關(guān)聯(lián)度計算 關(guān)聯(lián)度按兩比較序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)的均值計算。公式如下:

roi為子序列i與母序列o的關(guān)聯(lián)度，N為比較序列的數(shù)據(jù)個數(shù)。

2.3.3 排關(guān)聯(lián)序 將m個子序列對同一母序列的關(guān)聯(lián)度按大小順序排列起來，便組成關(guān)聯(lián)序，記為{X}，它直接反映各個子序列對母序列的“貢獻”的大小。據(jù)此可尋找指紋特征峰對應(yīng)的化學(xué)成分與藥效間的聯(lián)系。

2.3.4 譜效相關(guān)性分析 見表3～表7。

表3 醋莪術(shù)指紋圖譜共有峰與全血黏度關(guān)聯(lián)結(jié)果Tab.3 Results of correlation of whole blood viscosity and common peaks of fingerprint of the stir-baked Curcumae Rhizoma with vinegar

關(guān)聯(lián)結(jié)果表明，對于抗全血黏度作用，醋莪術(shù)中成分與之關(guān)聯(lián)度較大的前5個自變量，依次是色譜峰X6＞X9＞X11＞X12＞X13。

關(guān)聯(lián)結(jié)果表明，對于抗血漿黏度作用，醋莪術(shù)中成分與之關(guān)聯(lián)度較大的前5個自變量，依次是色譜峰X11＞X6＞X7＞X10＞X9。

表4 醋莪術(shù)指紋圖譜共有峰與血漿黏度關(guān)聯(lián)結(jié)果Tab.4 Results of correlation of blood plasma viscosity and common peaks of fingerprint of the stir-baked Curcumae Rhizoma with vinegar

表5 醋莪術(shù)指紋圖譜共有峰與血細胞聚集指數(shù)關(guān)聯(lián)結(jié)果Tab.5 Results of correlation of blood cell aggregation index numbers and common peaks of fingerprint of the stir-baked Curcumae Rhizoma with vinegar

表6 醋莪術(shù)指紋圖譜共有峰與血細胞沉降關(guān)聯(lián)結(jié)果Tab.6 Results of correlation of blood cell sedimentation and common peaks of fingerprint of the stir-baked Curcumae Rhlzoma with vinegar

關(guān)聯(lián)結(jié)果表明，對于抗血細胞聚集作用，醋莪術(shù)中成分與之關(guān)聯(lián)度較大的前5個自變量，依次是色譜峰X6＞X11＞X9＞X10＞X12。

關(guān)聯(lián)結(jié)果表明，對于抗血細胞沉降作用，醋莪術(shù)中成分與之關(guān)聯(lián)度較大的前5個自變量，依次是色譜峰X6＞X7＞X11＞X9＞X10。

表7 醋莪術(shù)指紋圖譜共有峰與紅細胞壓積關(guān)聯(lián)結(jié)果Tab.7 Results of correlation of VPRC and common peaks of fingerprint of the stir-baked Curcumae Rhlzoma with vinegar

關(guān)聯(lián)結(jié)果表明，對于紅細胞壓積作用，醋莪術(shù)中成分與之關(guān)聯(lián)度較大的前5個自變量，依次是色譜峰X6＞X9＞X7＞X10＞X11。

通過將10個批次醋莪術(shù)的16個共有色譜峰與其血液流變學(xué)5個藥效指標(biāo)相關(guān)聯(lián) (表中只列出前5個貢獻最大的色譜峰)發(fā)現(xiàn)，與醋莪術(shù)不同血液流變學(xué)指標(biāo)貢獻作用關(guān)聯(lián)度較大的色譜峰群不同，第6號、7號、9號、10號、11號、12號、13號色譜峰與醋莪術(shù)對氣滯血瘀證大鼠血液流變學(xué)的藥效作用相關(guān)性貢獻較大。因此，可判斷出這7個色譜峰為體現(xiàn)醋莪術(shù)破血作用的生物信息峰簇，但具體所反映的物質(zhì)成分，還需進一步的探索研究。

3 討論

中醫(yī)辨證施治用的是藥味而并非是單個化學(xué)成分，中藥指標(biāo)成分的控制，難以真正反映和評價中藥藥效。中藥的“行氣、活血、化瘀”等傳統(tǒng)功效，是藥材飲片或成藥制劑內(nèi)含有效物質(zhì)的整體作用結(jié)果，包括其所含的物質(zhì)數(shù)、物質(zhì)量和組成比例，不能只針對幾個化學(xué)成分，必須對物質(zhì)群整體予以控制。盡管中藥指紋圖譜方法采用多指標(biāo)比對的方法控制中藥質(zhì)量，被認為完整性地控制了中藥的物質(zhì)群體，但單純的化學(xué)指紋圖譜還不能很準(zhǔn)確地評價中藥的成分與其藥效之間存在的相關(guān)信息。

近年來，研究者［10］逐漸認識到中藥質(zhì)量評價中指標(biāo)性成分選擇的重要性，指標(biāo)成分選擇的單一性和專屬性差是目前中藥質(zhì)量控制的關(guān)鍵問題。因此，建立譜－效模型，將藥效學(xué)信息與化學(xué)指紋圖譜信息進行相關(guān)性研究，尋找與藥效相關(guān)的指紋峰或成分群，有利于中藥活性物質(zhì)基礎(chǔ)的篩選和中藥質(zhì)量有效性控制，是尋找中藥活性成分一種新思路。

目前構(gòu)建譜效模型采用的數(shù)據(jù)分析方法還不統(tǒng)一規(guī)范［11-12］，主要有相關(guān)分析、聚類分析、回歸分析、灰色關(guān)聯(lián)度分析、圖譜比對法等多種方法，各種方法各有優(yōu)點和不足，采用何種方法或多種方法組合使用來研究譜效關(guān)系仍需要進一步研究和探討。本研究在試驗過程中，曾采用SPSS 13.0的多元回歸分析對16個共有峰信息和5個藥效指標(biāo)進行相關(guān)聯(lián)，但采用多元回歸分析的強迫引入法時，由于將分析的所有變量一次性全部引入進行分析，因同時引入的變量較多，使各因素的影響變小，掩蓋了主要因素的作用，使其不能通過顯著性檢驗，從而難以保證兩者關(guān)聯(lián)的準(zhǔn)確性;而采用逐步回歸法時，按各因素的貢獻由大到小依次引入，每引入一個變量，就對其進行顯著性分析，但無法同時分析各因素的作用，因此，本試驗最終選擇了源自灰色系統(tǒng)理論的灰關(guān)聯(lián)分析法進行“譜-效”的相關(guān)分析，同時基于灰色系統(tǒng)理論中的灰關(guān)聯(lián)聚類法進行譜效模型的建立將有利于構(gòu)建一種新的模式識別模型。

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