于風(fēng)平， 胡昌勤

(1.淄博市藥品檢驗(yàn)所，山東淄博 255086;2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

刺五加Acanthopanax senticosus(Ruper.Et Maxim.)harms為五加科五加屬植物刺五加的干燥根和根莖及莖，含有刺五加苷、香豆素、刺五加酮、微量元素等多種藥理活性成分［1］，有益氣健脾、補(bǔ)腎安神的功效，主治脾腎陽虛，體虛乏力，食欲不振，腰膝酸痛，失眠多夢［2］。刺五加注射液由刺五加藥材經(jīng)“水提醇沉”工藝［3－4］制備而成，臨床上大量應(yīng)用于治療心腦血管疾病、心臟疾病、肺臟疾病、植物神經(jīng)功能紊亂等疾病［5］。近年來有關(guān)刺五加注射液不良反應(yīng) (ADR)的報(bào)道正逐年增多，其中過敏反應(yīng)是刺五加注射液的主要不良反應(yīng)［6］，其發(fā)生速度快、危害大;發(fā)生率與性別、劑量無顯著性差異［7］。國家藥品ADR檢測中心收到有關(guān)刺五加注射液嚴(yán)重ADR報(bào)告和死亡病例較多，有研究表明殘留在刺五加注射液中的植物蛋白等過敏性雜質(zhì)，可能是造成其臨床上過敏反應(yīng)時(shí)常發(fā)生的主要原因［8］。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M刺五加注射液生產(chǎn)工藝，從刺五加藥材中提取了刺五加抗原，并制備了特異性抗體，建立了間接ELISA法，經(jīng)過方法學(xué)的深入研究，證明該方法可以用于檢測刺五加注射液中的過敏性雜質(zhì)，這對探討含刺五加藥材的中藥注射劑不良反應(yīng)具有重要意義。

1 材料

1.1 試劑與藥品 胎牛血清、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、過氧化氫尿素、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑均來自Sigma公司;蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、Bradford蛋白試劑盒、透析袋來自Bio-RAD公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(蛋白質(zhì)量濃度為400 μg/mL)來自 Santa Cruz Biotechnoligy公司;96孔酶標(biāo)板購自天津天宇有機(jī)玻璃制品高分子技術(shù)有限公司;刺五加藥材由中國食品藥品檢定研究院提供;刺五加注射液共計(jì)6個(gè)廠家，92批樣品，為2006年全國監(jiān)督抽驗(yàn)樣品。

1.2 主要儀器 酶標(biāo)儀 (Multiskan Spectrum)為Thermo公司產(chǎn)品;離心機(jī) (AvantiTM30 Centrifuge)為Backman公司產(chǎn)品;洗板機(jī) (Model 1575)為Bio-RAD公司產(chǎn)品;真空干燥箱 (VDL115)為Binder公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物 新西蘭大白兔，4～5個(gè)月齡，體質(zhì)量2～3 kg，由中國食品藥品檢定研究院動物繁育場提供。

2 刺五加抗原及兔抗刺五加抗原抗體的制備

2.1 刺五加抗原的制備 取干燥的刺五加藥材粉碎，稱取粉末51.7 g置500 mL蒸餾瓶中，加水250 mL加熱回流提取2 h，過濾，濾渣加水150 mL繼續(xù)加熱回流1.5 h，過濾，合并2次的濾液，加熱濃縮至約80 mL，再次過濾，濾液加入等體積冰冷的無水乙醇，于4℃冷藏12 h，4℃條件下5 000×g離心20 min，棄去上清液，沉淀常溫減壓干燥，得到粉末0.31 g，作為刺五加抗原。

2.2 兔抗刺五加抗原抗體的制備 取刺五加抗原加水溶解并稀釋成10 mg/mL的溶液，分別與等體積的弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑充分乳化，制成免疫抗原1和免疫抗原2;新購買的家兔飼養(yǎng)1周后，參照文獻(xiàn)［9］的免疫方法，先用免疫抗原1進(jìn)行基礎(chǔ)免疫，每周1次，連續(xù)2周;再用免疫抗原2進(jìn)行加強(qiáng)免疫，每周1次。每次加強(qiáng)免疫5 d后，從耳動脈取血少許，按照間接ELISA法測試抗血清效價(jià)，第3次加強(qiáng)免疫后，抗血清效價(jià)達(dá)到1∶6 400，采取剝離頸動脈的方式取血并分離血清［9-10］。

取兔血清2 mL，加飽和的硫酸銨溶液2 mL，4℃靜置2 h，9 000×g離心10 min，沉淀溶于2 mL水中，加飽和的硫酸銨溶液2 mL，4℃再靜置2 h，9 000×g離心10 min，沉淀復(fù)溶于2 mL的PBS(0.01 mol/L，pH7.4)溶液中，裝入透析袋，4℃對200 mL的上述PBS溶液透析12 h，每隔3 h更換1次透析液［9-11］。純化后的抗體用上述PBS溶液定容至3 mL，作為兔抗刺五加抗原抗體?？贵w采用Brandford法［12］測定總蛋白量為5.35 mg/mL。

3 間接ELISA法的建立

3.1 間接ELISA法試驗(yàn)步驟［9］第1步，包被刺五加抗原溶液，每孔100 μL，4℃放置20 h，反復(fù)洗滌6次。第2步，用5%小牛血清溶液封閉，每孔275 μL，37℃反應(yīng)1 h，反復(fù)洗滌6次。第3步，加兔抗刺五加抗原抗體，每孔100 μL，37℃反應(yīng)1 h，反復(fù)洗滌6次。第4步，加0.4 μg/mL的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG溶液，每孔100 μL，37℃反應(yīng)1 h，反復(fù)洗滌9次。第5步，加TMB-H2O2尿素底物緩沖液，每孔100 μL，37℃暗處反應(yīng)約15 min。第6步，每孔加終止液50 μL。第7步，用酶標(biāo)儀記錄450 nm的吸光度讀數(shù)。

3.2 方陣滴定 刺五加抗原用包被液稀釋成256 μg/mL的溶液，作為起始質(zhì)量濃度，倍比稀釋，分別包被在酶標(biāo)板上，同時(shí)包被陰性 (包被液)和陽性 (兔抗刺五加抗原抗體)對照;兔抗刺五加抗原抗體，質(zhì)量濃度分別為 1.6、0.8、0.4、0.2、0.1 μg/mL，按照3.1項(xiàng)間接 ELISA法試驗(yàn)步驟作方陣滴定。最終選擇了最佳的抗體工作質(zhì)量濃度為0.8 μg/mL，最佳的刺五加抗原質(zhì)量濃度范圍為 4 ～128 μg/mL。

3.3 抗原包被時(shí)間 按照3.1項(xiàng)間接ELISA法試驗(yàn)步驟，考察質(zhì)量濃度為128 μg/mL的刺五加抗原，包被時(shí)間分別為 11、12、14、16、18、20、22、24 h，其在酶標(biāo)板上的結(jié)合情況。以吸光度值為縱坐標(biāo)，包被時(shí)間為橫坐標(biāo)做折線圖 (見圖1)，從圖中可以看到:隨著包被時(shí)間的增加，同一質(zhì)量濃度的刺五加抗原的吸光度值也相應(yīng)的增加，當(dāng)包被時(shí)間達(dá)到20 h時(shí)，包被時(shí)間再增加，刺五加抗原的吸光度值變化不大，可認(rèn)為其已經(jīng)較為完全的結(jié)合到96孔酶標(biāo)板上了。因此，當(dāng)刺五加抗原質(zhì)量濃度為128 μg/mL時(shí)，包被時(shí)間至少要20 h。

圖1 抗原吸光度值與包被時(shí)間的關(guān)系Fig.1 Relationship of absorbance and time

3.4包被液的選擇 取刺五加抗原，分別用水、pH7.4的PBS溶液和pH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋成128 μg/mL的溶液，包被在酶標(biāo)板上，按照3.1項(xiàng)間接ELISA法試驗(yàn)步驟進(jìn)行試驗(yàn)，考察不同包被液對試驗(yàn)結(jié)果的影響。結(jié)果包被液對試驗(yàn)結(jié)果影響很大，以pH9.6碳酸鹽緩沖液作為包被液效果最好。

3.5 封閉液及封閉時(shí)間的選擇 主要考察了5%脫脂奶粉和5%小牛血清分別封閉1 h、1.5 h的封閉效果。確定采用5%小牛血清封閉1 h。

3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取包被液稀釋的刺五加抗原溶液(128 μg/mL)，用包被液倍比稀釋，分別包被在96孔酶標(biāo)板上，按照3.1項(xiàng)間接ELISA法試驗(yàn)步驟進(jìn)行試驗(yàn)。以抗原質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)做線性回歸，得回歸曲線為Y=0.007 9X+0.08(R2=0.999)，抗原質(zhì)量濃度與吸光度值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系;本方法刺五加抗原質(zhì)量濃度的線性范圍為4 ～128 μg/mL。

3.7 檢出限與定量限 根據(jù)AOAC的標(biāo)準(zhǔn)，以陰性均值 (X)加3倍標(biāo)準(zhǔn)差 (SD，n=20)的和(X+3SD)作為本方法的檢出限，以陰性均值(X)加10倍標(biāo)準(zhǔn)差 (SD，n=20)的和 (X+10SD)作為本方法的定量限，確定本方法的檢出限約為 0.5 μg/mL，定量限約為 4 μg/mL。

3.8 精密度實(shí)驗(yàn) 取低 (8 μg/mL)、中 (32 μg/mL)、高 (100 μg/mL)3個(gè)質(zhì)量濃度的刺五加抗原溶液包被在同一酶標(biāo)板上，各包被10孔，按照3.1項(xiàng)間接ELISA法試驗(yàn)步驟進(jìn)行試驗(yàn)。低(8 μg/mL)、中 (32 μg/mL)、高 (100 μg/mL)3個(gè)質(zhì)量濃度的刺五加抗原溶液在同一酶標(biāo)板上的吸光度精密度分別為8.8%、6.9%、3.2% (n=10)。結(jié)果表明本方法的精密度較好。

3.9 樣品前處理 本實(shí)驗(yàn)采取了下列方式調(diào)節(jié)刺五加注射液的pH值和離子濃度:取樣品90 μL加入10倍濃度的包被液10 μL，對樣品的pH值和離子強(qiáng)度進(jìn)行調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)后的樣品pH值在9.6左右，與包被液的pH值接近。調(diào)節(jié)后的樣品按照3.1項(xiàng)間接ELISA法試驗(yàn)步驟進(jìn)行試驗(yàn)。

3.10 加樣回收率試驗(yàn) 將刺五加抗原加入到已知抗原質(zhì)量濃度的刺五加注射液 (抗原質(zhì)量濃度為4.8 μg/mL)中，使其刺五加抗原的加入量分別為4、16、32、100 μg/mL，按照3.9項(xiàng)樣品前處理和3.1項(xiàng)間接ELISA法試驗(yàn)步驟進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算平均加樣回收率。本方法的低、中、較高、高4個(gè)質(zhì)量濃度的加樣回收率分別為79.9%、87.7%、91.2%、96.3%，平均加樣回收率為88.8%，RSD為7.3%。見表1。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of the recovery tests

3.11 特異性 取不含刺五加藥材的丹參注射液、香丹注射液、魚腥草注射液、穿心蓮注射液、醒腦靜注射液、香丹冠心注射液各3批按照3.9項(xiàng)樣品前處理和3.1項(xiàng)間接ELISA法試驗(yàn)步驟進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果均未檢出過敏性雜質(zhì)。表明本實(shí)驗(yàn)所制備的兔抗刺五加抗原抗體特異性與刺五加抗原相結(jié)合，而與其他種類抗原不發(fā)生相互作用，本實(shí)驗(yàn)方法特異性的檢測來自刺五加藥材的過敏性物質(zhì)。

3.12 樣品測定 對來自于6個(gè)廠家的92批樣品進(jìn)行了檢測，共有8批 (8.7%)樣品檢出過敏性雜質(zhì)，其過敏性雜質(zhì)的量在0.5～10 μg/mL。

4 討論

4.1 間接ELISA試驗(yàn)結(jié)果顯示 92批刺五加注射液中，8批呈陽性，這8批樣品較為分散的分布在5個(gè)藥品生產(chǎn)企業(yè)的樣品中，提示刺五加注射液的生產(chǎn)工藝不完善具有普遍性。根據(jù)國家ADR監(jiān)測中心的數(shù)據(jù) (截至2007年10月31日)顯示，刺五加注射液的ADR(主要為過敏反應(yīng))報(bào)告涉及的藥品生產(chǎn)企業(yè)40余家，而這5個(gè)企業(yè)產(chǎn)品的ADR報(bào)告量占前五位，總比例達(dá)到了94.5%。從刺五加注射液的市場抽驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這5個(gè)企業(yè)的產(chǎn)品約占本次抽驗(yàn)數(shù)量的97.8%(按批計(jì)算)，推斷在臨床使用上，這5個(gè)企業(yè)的產(chǎn)品占據(jù)絕大數(shù)，因此認(rèn)為刺五加注射液ADR的發(fā)生率可能與其臨床用藥的數(shù)量有一定的關(guān)系。

表2 樣品數(shù)量、陽性率與ADR發(fā)生率Tab.2 Quantity of sample，positive sample and ADR

4.2 本實(shí)驗(yàn)中間接ELISA法各試驗(yàn)步驟中的反應(yīng)時(shí)間、洗滌次數(shù)、溫度，都是經(jīng)過多次反復(fù)實(shí)驗(yàn)的最終選擇。若洗滌次數(shù)不夠，就造成試驗(yàn)的陰性值增高，方法的靈敏度下降;若包被時(shí)間低于20 h，刺五加抗原不能完全結(jié)合到酶標(biāo)板上，抗原質(zhì)量濃度與吸光度值就不能呈現(xiàn)一次線性關(guān)系，可出現(xiàn)拋物線關(guān)系，但方法的精密度和準(zhǔn)確度就會降低;該方法的各試驗(yàn)步驟需要采用固定的溫育溫度、反應(yīng)時(shí)間，才能保證實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。

4.3 在加樣回收率試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入低質(zhì)量濃度的刺五加抗原溶液時(shí)，平均加樣回收率較低，主要是由于抗原濃度太低，位于線性范圍的下限，測定結(jié)果的準(zhǔn)確性較低所致;當(dāng)加入高質(zhì)量濃度的刺五加抗原溶液時(shí)，平均加樣回收率高達(dá)96.3%。另一方面，中藥注射液中的成分復(fù)雜，樣品中的某些物質(zhì)可能干擾測定，也會導(dǎo)致加樣回收率低。在精密度試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，同一樣品在同一塊酶標(biāo)板上多次測定，其精密度良好;但同一樣品在不同的酶標(biāo)板上多次測定，其吸光度差別較大，只有采用每一塊酶標(biāo)板都做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校正后，測定結(jié)果的精密度方可達(dá)到試驗(yàn)要求。

4.4 本實(shí)驗(yàn)建立的間接ELISA法對于刺五加注射液中的痕量過敏性雜質(zhì)檢測具有重要的臨床指導(dǎo)意義，該方法具有較高的精密度、較好的加樣回收率、高靈敏度、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可以用于刺五加注射液中過敏性雜質(zhì)的定性和定量分析。

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