崔佳麗， 山麗梅， 趙艷玲， 張 萍， 王伽伯， 李寶才， 肖小河

(1.解放軍302醫(yī)院全軍中醫(yī)藥研究所，北京 100039;2.昆明理工大學生命科學與技術(shù)學院，云南昆明 650224;3.解放軍302醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)學中心，北京 100039)

自1971年 Combes等［1］首次描述了第一例具有持續(xù)HBsAg血癥的患者發(fā)生了膜性腎病至今，腎小球腎炎已被公認為是乙型肝炎病毒 (HBV)感染引起的最常見肝外病變，又稱HBV相關(guān)性腎炎。在我國，HBV相關(guān)性腎炎發(fā)病率很高，約為乙肝患者的16.6%～32%，此病發(fā)病機制尚不明確，臨床治療需要兼顧肝病和腎病，既需要抑制腎臟的免疫反應，又不能因免疫抑制使乙型肝炎病毒復制增強，用藥矛盾突出，臨床上治療難度大，尚缺乏有效治療藥物。

解放軍302醫(yī)院是全國最大的三級甲等傳染病醫(yī)院。在長期臨床應用中總結(jié)出應用大黃甘草方治療HBV相關(guān)性腎炎的協(xié)定處方，臨床效果顯著。大黃甘草湯是臨床常用經(jīng)典方 (張仲景《金匱要略》)，由大黃、甘草兩味藥組成。其有效治療HBV相關(guān)性腎炎的機制可能與大黃蒽醌和甘草酸均具有明確的抗乙肝病毒和免疫調(diào)節(jié)［2-6］雙重作用相關(guān)。大黃甘草湯臨床應用劑型主要為湯劑、散劑，而其臨床治療HBV相關(guān)性腎炎的劑型為湯劑、水煎服，不便于患者應用，故在大黃甘草湯治療HBV相關(guān)性腎炎臨床療效肯定的基礎(chǔ)上，將其開發(fā)為首個治療HBV相關(guān)性腎炎的中藥制劑-大黃甘草膠囊，具有一定社會及經(jīng)濟意義。本實驗結(jié)合2010年版《中國藥典》［7］中有關(guān)大黃、甘草含量測定相關(guān)規(guī)定，將大黃酸等5種蒽醌、甘草酸作為優(yōu)選大黃甘草湯最優(yōu)提取方式的指標成分，應用正交試驗法優(yōu)選大黃甘草膠囊的提取工藝，以浸膏得率、總蒽醌 (大黃酸等5種蒽醌單體之和)、甘草酸含量為指標采用綜合評分法［8］來進行工藝條件優(yōu)化。

1 儀器與試藥

Agilent 1200 HPLC高效液相色譜儀 (Agilent，四元梯度泵，自動進樣，Angilent工作站)，AL204電子天平 (瑞士梅特勒-托利多公司)。

大黃、甘草飲片由解放軍第302醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)肖小河研究員鑒定為蓼科植物藥用大黃Rheum officinaleBaill.、光果甘草Glycyrriza glabraL.的干燥根和根莖。對照品大黃素 (批號:110795-200505)、大黃酚 (批號:110796-200716)、大黃酸 (批號:110757-200206)、大黃素甲醚 (批號:110758-200610)、蘆薈大黃素 (批號:110799-200806)、甘草酸單銨鹽 (批號:110799-200615)購自中國藥品生物制品檢定所，甲醇、乙腈 (色譜純，Sigma公司)。其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 5種蒽醌單體及甘草酸測定

2.1.1 色譜條件 蒽醌類成分:Kromasil C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相為甲醇－0.1%磷酸水溶液(85∶15)，體積流量1.0 mL/min;檢測波長254 nm;進樣量 10 μL;柱溫25 ℃［9］。

甘草酸:Kromasil C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相為乙腈-0.1% 磷酸水溶液 (乙腈:0～5 min，19%～25%;5～19 min，25%～50%;19～20 min，50%～100%)，體積流量1.0 mL/min;檢測波長250 nm;進樣量10 μL;柱溫 25 ℃［7］。

色譜圖見圖1。

圖1 大黃甘草湯中5種蒽醌單體、甘草酸HPLC圖

2.1.2 對照品溶液的配制 精密稱取大黃素等5種對照品適量，置于同一量瓶中，甲醇溶解，稀釋至刻度。作為含大黃素、大黃酸、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚各50 μg/mL的混合對照品溶液貯備液。對照品溶液為此貯備液按一定比例稀釋，含各成分10 μg/mL。

精密稱取甘草酸銨對照品適量，置于量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。得到含甘草酸銨100 μg/mL的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取過60目大黃甘草湯浸膏粉末約0.2 g，精密稱定。

用于蒽醌單體測定的樣品溶液:加入25 mL甲醇加熱回流1 h，放冷，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5 mL，揮去甲醇，加8%鹽酸溶液10 mL，超聲2 min，再加入CHCl310 mL，加熱回流處理1 h，放冷，置分液漏斗中，分取CHCl3層，酸液再用CHCl3萃取3次，每次10 mL，合并CHCl3液，減壓回收溶劑至干，殘渣加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過0.22 μm濾膜，即得。

用于甘草酸測定的樣品溶液:置于10 mL量瓶中，以甲醇溶解，超聲處理 (功率250 W，頻率40 kHz)60 min，甲醇定容至刻度，搖勻，過0.22 μm濾膜，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取蒽醌類、甘草酸單銨鹽對照品溶液 0.02、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容，10 μL進樣測定。以標準溶液質(zhì)量濃度X對色譜峰面積Y進行線性回歸，得回歸方程，結(jié)果見表1。

表1 標準曲線

2.1.5 精密度試驗 取同一質(zhì)量濃度的對照品溶液連續(xù)進樣5次，測定峰面積，計算得6對照品RSD值范圍為0.22%～0.81%。表明該方法精密度良好。

2.1.6 重復性試驗 將同一樣品，按2.1.3項下樣品制備方法平行制備6份樣品溶液，測定峰面積，計算得6組分RSD值范圍為0.20%～1.70%。表明本法重復性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取同一樣品溶液于室溫下0、2、4、6、8、12 h分別進樣，測定峰面積，計算得6組分RSD值范圍為0.24%～1.87%。表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 回收率試驗 精密稱定已知量的同一提取物樣品3份，分別精確加入6種對照品溶液，各份均按2.1.3項下方法制備樣品，測定峰面積，計算回收率，結(jié)果見表2。

表2 回收率實驗

2.2 提取方法 根據(jù)L9(34)正交試驗因素水平表，分9組實驗，每組取日處方量13.5 g(大黃9 g、甘草4.5 g)，精密稱定。置250 mL圓底燒瓶中，按安排表中實驗條件，加熱回流提取，各提取液60℃旋蒸并干燥至恒定質(zhì)量。

2.3 正交試驗設(shè)計 依據(jù)L9(34)正交試驗設(shè)計，綜合考慮總蒽醌、甘草酸、浸膏提取率三項指標，考察溶劑量、提取時間、提取次數(shù)對上述指標的影響，結(jié)合臨床實際應用，選取各水平，見表3。

表3 L9(33)正交試驗因素水平

2.4 正交試驗結(jié)果 按照L9(34)正交設(shè)計表的條件進行試驗，分別測得大黃酸等5種蒽醌單體、甘草酸的量和浸膏得率，并進行多指標綜合評分。評分時以各指標的最大值為參照將數(shù)據(jù)進行歸一化，再給出不同的權(quán)重。總蒽醌和甘草酸的權(quán)重系數(shù)分別設(shè)為0.4和0.4。在原大黃甘草湯方在臨床應用中日服用量較少、效應成分不很明確的前提下，浸出物得率越高則指標成分提取量越高，因此設(shè)定浸出物得率的權(quán)重系數(shù)為0.2。以綜合值進行統(tǒng)計分析，其中綜合評分M=0.4X×100/135.15+0.4Y×100/95.15+0.2Z×100/45.55。依據(jù)綜合評分結(jié)果輸入SPSS系統(tǒng)進行分析。

結(jié)果見表4。SPSS數(shù)理統(tǒng)計軟件方差綜合分析見表5。

表4 L9(34)正交試驗設(shè)計及實驗結(jié)果

表5 L9(34)正交試驗方差分析結(jié)果

2.5 正交試驗結(jié)果分析 以綜合評分為標準，在所選因素水平范圍內(nèi)，由表4、5直觀分析結(jié)果顯示，各因素主次順序為C＞A＞B，各因素的影響水平為:A因素以第三水平影響最大，B因素以第一水平影響最大，C因素中以第三水平影響最大。綜合分析表結(jié)果表明，只有C因素即提取次數(shù)對綜合分析結(jié)果有顯著性影響 (P＜0.05)，A(溶劑量)因素與B(提取時間)因素對試驗結(jié)果無顯著性影響 (P＞0.05)。考慮實際應用，確定最優(yōu)提取方法為A1B1C3，即加水量8倍，每次1 h，提取3次。

2.6 驗證試驗 按處方量10倍精密稱取藥材飲片135 g，按優(yōu)選出的提取方法進行3批驗證試驗并測定各指標成分，結(jié)果見表6。

表6 驗證實驗結(jié)果

驗證試驗結(jié)果證明，本調(diào)配方法穩(wěn)定可靠。

3 討論

優(yōu)選提取工藝的目的是將可能發(fā)揮藥效的部位得到最大程度的提取。本實驗采用的多指標綜合評價分析結(jié)果較單一指標的評價更為科學合理。用多指標正交實驗進行工藝優(yōu)選時，首先要針對指標間的重要性差異給出各指標權(quán)重，綜合評分后再進行統(tǒng)計分析。本實驗中大黃和甘草在正交實驗中所得大黃總蒽醌、甘草酸的量隨提取條件變化的趨勢相同，故將這兩者有效成分的量權(quán)重均定為0.4。在原大黃甘草湯方在臨床應用中日服用量較少、效應成分不是很明確的前提下，浸出物得率越高則指標成分提取量越高，因此設(shè)定浸出物得率的權(quán)重系數(shù)為0.2。根據(jù)這一思路，本實驗在充分尊重大黃甘草湯臨床治療HBV相關(guān)性腎炎應用的基礎(chǔ)上，應用正交實驗設(shè)計對大黃甘草膠囊進行提取工藝的優(yōu)選，為其開發(fā)為治療HBV相關(guān)性腎炎的首個中藥制劑做基礎(chǔ)研究。

本實驗采用因素為溶劑量、提取時間和次數(shù)的正交設(shè)計法，以浸膏得率、總蒽醌、甘草酸的量為指標，綜合分析得到最佳理論組合為A1B1C3，并經(jīng)驗證試驗最終確定提取工藝為8倍量水提取3次，每次1 h，即A1B1C3。其中提取次數(shù)對浸膏得率、總蒽醌、甘草酸的量影響最大，有顯著性差異 (P＜0.05)。溶劑量、提取時間三項水平間沒有顯著性差異 (P＞0.05)，影響較小。結(jié)果表明提取工藝簡單，可靠，可作為治療HBV相關(guān)性腎炎的新中藥制劑大黃甘草膠囊的提取工藝。

［1］Combes B，Shorey J，Barrera A，et al.Glomerulonephritis with deposition of Australia antigen-antibody complexes in glo-merular basement membrane［J］.Lancet，1971，2(7718):234-241.

［2］李 文，鄒正宇，查 贛，等.170種中草藥抗乙型肝炎病毒的實驗研究［J］.世界華人消化雜志，1999，7(1):89-90.

［3］南海江，許旭東，陳士林，等.大黃屬植物研究進展［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2009，21:690-701.

［4］胡志厚.甘草酸類藥物的研制及應用［J］.藥學學報，1988，23(7):553.

［5］馬 迪，唐 閣.大黃免疫功能的研究進展［J］.中醫(yī)藥學刊，2006，8:1505-1507.

［6］掘籠大之.甘草酸對自身免疫性疾病的治療作用［J］.國外醫(yī)學 (中醫(yī)中藥分冊)，2002，24(2):126.

［7］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

［8］賀福元，彭關(guān)富，羅杰英，等.多指標全概率評分法對鶴蟾顆粒劑提取工藝的研究［J］.中國中藥雜志，2001，26(4):251-252.

［9］Wang Jiabo，Li Huifang，Jin Cheng.Development and validation of a UPLC method for quality control of rhubarb-based medicine:Fast simultaneous determination of five anthraquinone derivatives［J］.J Pham Biomed Anal，2008，47(4-5):765-770.

［10］李 麗，周 軍，張 瑩，等.多指標全概率評分法優(yōu)化痛風寧顆粒提取工藝［J］.中成藥，2007，29(2):281-283.