嵇源源， 楚小晶， 王劍文

(蘇州大學藥學院，江蘇蘇州 215123)

PC12細胞是大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤分化的細胞株，是一種兒茶酚胺細胞，能合成貯存并釋放適量的兒茶酚胺 (主要是多巴胺和去甲腎上腺素)，具有典型的神經細胞特征，常用于神經細胞死亡方式和神經毒性損害研究［1］。PC12細胞曾經用于抗神經系統退行性疾病的藥物如雷帕霉素、L-肌肽等的開發(fā)［2-3］。目前，有關PC12細胞應用于天然藥物的神經損傷保護機制的研究報道也日漸增多［4-5］，在具有神經保護作用的天然藥物篩選中，PC12細胞模型已逐漸得到廣泛應用。但尚未見PC12細胞體外損傷模型建立方法以及利用該模型進行中藥活性成分篩選的文獻綜述。本文將系統介紹PC12細胞建立的體外模型、方法和具有保護活性的中藥活性成分，為神經系統退行性疾病天然藥物開發(fā)研究提供依據和參考。

1 PC12建立的體外模型

PC12細胞表面存在大量的神經生長因子受體，神經生長因子可誘導PC12細胞分化成交感神經元樣細胞，從而在形態(tài)生理生化及功能方面更接近于神經元，是體外研究神經細胞分化及信號轉導機制的主要模型［6］。未分化的PC12可看作未成熟的神經元，建立體外模型時通常采用未分化的PC12細胞。

1.1 帕金森病的細胞損傷模型 許多神經毒素如6-羥基多巴胺 (6-hydroxydopamine)，1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶 (MPTP)，農藥殺蟲劑魚藤酮、百枯草等在體內可以引起帕金森病，病理機制包括氧化應激、抑制線粒體氧化呼吸鏈、神經元的凋亡等。應用上述神經毒素損傷PC12細胞，建立帕金森模型可進行帕金森病理觀察和細胞生物化學變化等方面的測定。

1.1.1 MPP+損傷模型 MPTP是一種神經毒素，在腦內可轉化為MPP+，最終導致多巴胺能神經元變性、死亡。選用MPP+(200～600 μmol/L)分別作用PC12細胞12～48 h，最佳建模條件為500 μmol/L MPP+損傷細胞24 h，細胞存活率為56%［7］?；钚蕴烊划a物紅景天苷［7］、芍藥苷［8］等對其損傷具有保護作用。

1.1.2 百草枯損傷模型 百草枯是一種除草劑，結構類似于MPP+，也可用來建立帕金森模型。以百草枯 (200～1 000 μmol/L)分別損傷PC12細胞12～48 h建立體外模型，24 h細胞活力為49.11% ～81.12%，最佳造模條件為800 μmol/L百草枯損傷PC12細胞24 h［9-10］。表沒食子兒茶素沒食子酸酯［10］及五味子乙素［11］等對該模型都具有保護作用。

1.1.3 6-羥基多巴胺損傷模型 6-羥基多巴胺神經毒素能選擇性作用于兒茶酚胺能神經元，是多巴胺能神經細胞的毒劑。采用6-羥基多巴胺損傷PC12細胞建立模型，具有時間濃度依賴性，PC12細胞經過250 μmol/L 6-羥基多巴胺24 h和36 h的損傷后細胞存活率為63%和45%，選用250 μmol/L，24 h為最佳造模條件［12］。谷精草提取物［13］、表沒食子兒茶素沒食子酸酯［14］等對該模型具有保護功能。

1.1.4 魚藤酮損傷模型 魚藤酮是從醉魚豆屬植物毛魚藤Derris ellipticaBenth的根、葉中分離出的主要化學成分，可透過細胞膜存在于線粒體，抑制線粒體呼吸鏈復合物I，發(fā)揮細胞毒作用［15］。魚藤酮常用于建立帕金森的細胞模型［16］，對PC12細胞的損傷具有濃度依賴性 (0.5～1.0 mmol/L)，細胞的存活率從 76.01% 降低到 58.87%［17］。槲皮素［18］、Bu-7［19］等活性天然產物具有保護作用。

1.2 阿爾茲海默病模型

β-淀粉樣蛋白 (Aβ)損傷模型 原代培養(yǎng)的神經元建立阿爾茲海默病模型能夠相對較好地模擬在體神經元的病變，但存在培養(yǎng)系統不穩(wěn)定，重復性和同一性較差等問題，因此PC12細胞越來越多的用于研究阿爾茲海默病病理，在實驗研究中經常采用Aβ的活性片段Aβ25-35誘導PC12細胞凋亡建立阿爾茲海默病的細胞模型［20］，損傷的濃度通常為20 ～30 μmol/L，時間為 24 h。雷公藤提取物［21］、人參皂苷 Rb1［22］等均有保護作用。

1.3 其他損傷模型 近年來，帕金森病和阿爾茲海默病的細胞模型的研究中發(fā)現幾乎全部的神經毒素都能使PC12細胞產生氧化應激，氧化應激是凋亡的中介物，凋亡又被認為是神經退化性疾病病理變化的一個重要環(huán)節(jié)，因而有更多研究者建立PC12的氧化模型研究其機制。在體內，各種途徑可以產生的活性氧 (ROS)，包括過氧化氫(H2O2)、一氧化氮 (NO)、過氧自由基等，其中H2O2是最常用的外源刺激PC12的氧化物質，0.5 mmol/L H2O2處理細胞后，細胞存活率降至50%左右［23-24］。

與給予氧化損傷相對的是在PC12細胞上建立氧糖剝奪模型 (oxygen-glucose-deprivation)，即使用無糖無血清培養(yǎng)基，置于充入95%N2和5%CO2的低氧小室，隨著時間的增加 (12～48 h)，細胞活力逐漸下降 (68% ～20%)［25-26］。此外，氯胺酮［27］、甲醛［28］、酒精［29］及單壁碳納米管［30］等也可引起PC12的損傷。

2 對PC12細胞損傷具有保護作用的天然產物

通過PC12細胞建立的上述各種實驗模型，可以篩選對PC12細胞有保護作用，具有治療疾病潛能的有效物質。近年來已通過此模型篩選得到多種中藥活性成分。

2.1 具有保護作用的植物提取物 銀杏葉提取物 (EGb)是從銀杏科植物銀杏Ginkgo biloba的葉片中提取的有效成分，在百草枯誘導PC12細胞凋亡模型中，EGb761的成分是24%黃酮苷，6%萜類和其他組成成分，預處理后細胞存活率由 53.3% 上升到 82.4%［9］。EGb761對 H2O2、MPP+造成的PC12細胞損傷均有保護作用［31-32］。菟絲子是臨床常用中藥，為旋花科植物菟絲子Cuscucta chinensisLam.干燥成熟的種子。菟絲子提取物 (100 mg/L)能提高MPP+損傷的PC12細胞存活率約28.7%，凋亡比率由31.9% ±2.8%降低到6.3% ±0.16%［33］。枸杞提取物對MPP+誘導的PC12細胞神經毒性具有保護作用，能夠抗氧化及恢復谷胱甘肽 (GSH)水平，MTT法檢測細胞存活率從57.45% ±10.45% 上升至79.15% ±9.93%［34］。谷精草為谷精草科植物谷精草Eriocaulon buergerianumKoern.的干燥帶花莖的頭狀花序，對6-羥基多巴胺誘導的PC12細胞損傷具有保護作用，其作用機制可能與降低NO的產生量和一氧化氮合酶 (iNOS)的表達量有關［13］。雷公藤提取物保護Aβ損傷的PC12細胞，其機制與拮抗細胞內Ca2+增加和抑制細胞凋亡有關［21］。貫葉連翹Hypericum perforatumL.富含黃酮類化合物，可以保護H2O2作用的PC12細胞，增加細胞存活率，降低乳酸脫氫酶 (LDH)的水平［35］。

2.2 活性成分

2.2.1 黃酮類 原花青素在Aβ25-35誘導PC12的損傷中可以抑制凋亡以及細胞在S期的阻滯，使p53蛋白的表達增加［36］，進而增加細胞存活率，保護PC12細胞。葛根素對Aβ［37］、MPP+［38-39］、H2O2［40］誘導 PC12 的損傷均有抗凋亡的保護作用，降低對PC12細胞的損傷。木犀草素通過抑制神經突生長，增加細胞的抗氧化能力保護細胞［41］。H2O2可以引起PC12細胞鈣通道蛋白的調節(jié)異常和ROS的爆發(fā)，槲皮素通過拮抗該作用提高細胞存活率［42］。

黃芩苷和黃芩素是一種黃酮類化合物，可以抑制PC12細胞缺血性損傷后ROS的產生以及p38的激活，從而保護PC12細胞［43］。黃芩素可以抑制H2O2引起的PC12細胞的氧化損傷和凋亡［44］。燈盞乙素的結構是4，5，6-三羥基黃酮-7-葡萄糖醛酸苷，對低氧糖模型具有保護作用，可以減少LDH釋放，降低Ca2+水平和凋亡率［45］。金絲桃苷又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷，在H2O2以及叔丁基過氧化氫誘導細胞凋亡的模型中，通過抗氧化抑制PC12細胞凋亡［46］。從豆科植物中提取的黃豆苷元和染料木苷對6-羥基多巴胺具有細胞毒保護作用［47］。淫羊藿苷是從淫羊藿Epimedium davidiiFranch中提取的黃酮類化合物，可以抑制tau蛋白的過磷酸化，保護Aβ對PC12細胞的損傷［48］。Bu-7(化合物1)是從黃皮Clausena lansium中提取的一種類黃酮，通過恢復線粒體膜電位，抑制魚藤酮誘導蛋白的過磷酸化，調節(jié)蛋白的表達保護PC12細胞，且化合物1本身不會引起細胞的凋亡［19］。橙皮素也可保護H2O2損傷的PC12 細 胞［49］。從 知 風 草Eragrostis ferruginea(Thumb)Beauv中提取了1種新黃酮化合物7-demethylageconyflavone(化合物2)和5種已知黃酮化合物tricin(化合物3)、ageconyflavone A(化合物4)、corylin(化合物5)、nectandrin B(化合物6)、4-ketopinoresinol(化合物7)均能使PC12細胞的EC50升高［50］?；衔锝Y構見圖1。

2.2.2 生物堿類 Neoechinulin A(結構見圖2)是海洋真菌中提取的吲哚類生物堿，它通過降低三磷酸腺苷 (ATP)水平保護魚藤酮損傷的PC12細胞［51］。在MPP+建立的帕金森模型中，Neoechinulin A可以改善線粒體復合物Ⅰ的合成而減少細胞毒作用［52］。

小檗堿是一種苯并異喹啉類季銨型生物堿。Kwon等研究小檗堿對陜西省爾茲海默病引起的細胞損傷的保護作用，發(fā)現它能抑制細胞凋亡，增加細胞存活率［53］。胡椒堿通過抗氧化作用保護MPP+損傷的PC12細胞［54］。

2.2.3 酚酸類 表沒食子兒茶素沒食子酸酯占綠茶多酚的25%～40%左右，是綠茶中的主要活性成分。表沒食子兒茶素沒食子酸酯對百草枯［10］、MPP+［55］、6-羥基多巴胺［14］誘導的PC12細胞凋亡均具有保護作用。益智仁原兒茶酸對H2O2［56］，MPP+［57］、魚藤酮［58］損傷的 PC12 細胞通過抗凋亡發(fā)揮其神經保護作用。

圖1 幾種具有神經保護活性的黃酮類化合物的結構式

圖2 Neoechinulin A結構式

2.2.4 糖苷類物質 紅景天苷屬于類苯基丙烷苷類，在MPP+的損傷過程中可以提高PC12細胞的存活率，并且首次發(fā)現紅景天苷可通過抑制NO通路來保護PC12細胞對抗MPP+誘導的凋亡［7］。紅景天苷也可保護低糖低血清、H2O2損傷的 PC12 細胞［25，59］。松果菊苷是葡糖苷類化合物，可以保護H2O2損傷的PC12細胞，提高細胞的存活率，降低凋亡率［60］。芍藥苷可以保護MPP+以及酸損傷引起PC12細胞的自噬，下調LC-3等自噬蛋白的表達［8］。南嶺柞木苷G(結構見圖3)與聚集狀的Aβ25-35共同孵育，可提高細胞存活率，流式細胞儀檢測凋亡率從34.26%降低到22.62%，并伴隨ROS的產生［61］。

圖3 南嶺柞木苷結構式

2.2.5 皂苷類 人參皂苷是三萜皂苷，包含多種成分:人參皂苷Rg1通過抑制NF-κB的激活保護H2O2損傷的PC12細胞［62］。通過增加細胞存活率，抑制LDH和NO的釋放保護Aβ損傷的PC12［63］。人參皂苷Rb1通過清除ROS，抗氧化保護Aβ對PC12的損傷［22］。人參皂苷Rb3在氧糖剝奪模型中起保護作用［64］。人參皂苷Rd在氧糖剝奪模型和H2O2損傷模型中，均提高抗氧化酶的活性起到抗氧化的作用而保護 PC12細胞［65］。人參皂苷Re在 Aβ或無血清對PC12造成的損傷中，提高細胞存活率、降低LDH水平，保護細胞受損［66］。遠志皂苷是五環(huán)三萜類皂苷，保護H2O2造成的PC12細胞的損傷［67］。低氧可以誘導PC12細胞的損傷，大蒜總皂苷可以保護低氧誘導PC12細胞的損傷［68］。

2.2.6 萜類 桃葉珊瑚苷 (結構見圖4)屬于環(huán)烯醚萜苷類，對H2O2損傷的PC12細胞具有保護作用［69-70］，增加細胞存活率，降低凋亡率。梓醇主要存在于地黃Rehmannia glutinosa等植物中，在氧糖剝奪和氧化損傷模型中起神經保護作用［71-72］。胡黃連苷-Ⅱ (結構見圖 4)可以協助PC12細胞抵抗H2O2的氧化損傷作用［73］。MPP+或H2O2損傷PC12細胞后，齊墩果酸、烏索酸能提高細胞存活率［74］?？屏_索酸 (結構見圖4)來源于大花紫薇Lagerstroemia speciosa的提取物，在低氧糖模型中，可顯著提高細胞活力，降低上清液LDH水平，增強損傷細胞內Na+-K+ATP酶活，保護PC12細胞［75］。白果內酯是銀杏葉提取物的主要有效成分，對于Aβ損傷的PC12細胞具有保護作用［76］。

2.2.7 苯丙素類 和厚樸酚與厚樸酚是具有酚式羥基的木脂體，可以保護Aβ對PC12細胞的神經毒性作用［77］。五味子乙素是從五味子中提取出來的活性物質，可以保護百草枯對PC12細胞的損傷［11］。紫花前胡素提高了PC12細胞對Aβ氧化損傷的抵抗作用［78］。蛇床子素通過減少產生降低MPP+對PC12細胞的損傷，抑制凋亡，達到保護目的［79］。

圖4 幾種具有保護作用的萜類化合物結構式

2.2.8 其他 姜黃素是二酮類化合物，低濃度姜黃素可以拮抗魚藤酮、MPP+致PC12細胞的損傷［80-81］。姜黃素也可以抑制Aβ對PC12細胞的氧化損傷［82］、減弱H2O2對PC12細胞的損傷［23］?；ㄉ南┧峥梢砸种频脱跻l(fā)的細胞內Ca2+水平的升高，保護PC12細胞［83］。大麻二酚 (結構式見圖5)能拮抗 Aβ1–42導致的PC12細胞內亞硝酸鹽的增加，使細胞免于損傷［84-85］。

圖5 大麻二酚結構式

3 結語

對PC12細胞損傷具有保護作用的中藥活性成分，具有開發(fā)成為治療神經性疾病天然藥物的潛在價值，在細胞水平上的研究表明保護的機制與ROS以及凋亡有關，活性天然產物針對凋亡途徑的關鍵步驟進行保護，例如拮抗細胞內鈣超載［22］，抑制 ROS 和氮氧基 (NO·)的產生［7，66］，導致下游凋亡蛋白的調節(jié)［42］。研究PC12細胞的損傷保護機制，可以針對靶點篩選大量化合物，為神經系統退行性疾病藥物開發(fā)研究提供依據。目前，PC12的細胞模型仍在不斷的發(fā)展和進步中，新的誘導物蛋白酶體抑制劑能有效地抑制泛素-蛋白酶體系［86］，中藥活性成分在該模型上尚未進行篩選研究。PC12細胞易獲得、可傳代，可以快速方便的進行初期篩選，然后在此基礎上進一步在神經元和動物體內進行神經藥理研究，達到有效提高研究效率，節(jié)約研究成本之目的，PC12細胞模型的建立對于神經退行性疾病的天然藥物篩選具有重要意義。

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