張 浩， 張 慶

(湖北省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，湖北武漢 430064)

鎮(zhèn)痛口服液處方由洋金花、制草烏、鬧羊花、細辛、姜黃五味藥組成，具有活血通絡(luò)、散寒止痛的功效，用于血栓閉塞性脈管炎、肝癌、乳腺癌、胃癌等腫瘤屬寒凝淤滯所致的疼痛。原質(zhì)量標準為國家藥監(jiān)局注冊標準WS3-734(Z-138)-2005(Z)，用TLC-SCAN法測定東莨菪堿的量，方法精密度、準確度均較差，無法很好控制產(chǎn)品質(zhì)量。本實驗采用HPLC法測定洋金花中主要生物堿類成分的量，方法準確，可控性更強。

1 儀器與試藥

Waters e2695-2489高效液相色譜儀、DIONEX U3000高效液相色譜儀、DIONEX P680高效液相色譜儀;Phenomenex Luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、DIONEX Acclaim 120 C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)、依利特 Kromasil C18(250 mm ×4.6 mm，5μm)色譜柱;AG135型電子天平;MS204S/Z型電子天平。氫溴酸東莨菪堿 (批號100049-200308供定量測定用)、硫酸阿托品 (批號100040-200510供定量測定用)，購于中國藥品生物制品檢定所;乙腈、庚烷磺酸鈉為色譜純;甲醇、乙酸鈉、冰醋酸為分析純;水為重蒸水。鎮(zhèn)痛口服液由李時珍醫(yī)藥集團有限公司提供，批號:201109001、201109002、201109003。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 參考《中國藥典》2010年版一部洋金花藥材含量測定項下色譜條件［1］，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，選擇相應(yīng)離子對試劑，進行試驗，結(jié)果以乙腈－0.05 mol/L乙酸鈉 (含0.012 5 mol/L庚烷磺酸鈉，用冰醋酸調(diào)pH至6.0)(20∶80)為最佳流動相。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 針對生物堿類成分進行提取純化。精密量取本品50 mL，置分液漏斗中，加稀鹽酸調(diào)pH值至1～2，搖勻，加三氯甲烷振搖提取3次，每次30 mL，棄去三氯甲烷層，分取酸水層，加氨試液調(diào)節(jié)pH值9～10，搖勻，加三氯甲烷提取5次，每次30 mL，合并三氯甲烷層，揮干，殘渣加流動相使溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備 取兩種對照品適量，精密稱定，加流動相制成每1 mL含氫溴酸東莨菪堿0.35 mg(折算成東莨菪堿為0.24 mg)、硫酸阿托品90 μg的溶液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 取處方中缺洋金花的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性樣品溶液。

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 專屬性 取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液，分別依法測定，同時測定相應(yīng)時間的DAD光譜圖，在該色譜條件下，在與氫溴酸東莨菪堿、硫酸阿托品保留時間相同的位置不出現(xiàn)色譜峰，表明其他成分對兩者測定無干擾，見圖1。

圖1 混合對照品溶液 (A)供試品溶液 (B)與陰性對照溶液 (C)色譜圖Fig.1 HPLC chromotographs of reference substance(A)，sample(B)and solution without scopolamine hydrobromide and atropine sulfate(C)

2.3.2 線性關(guān)系考察 取混合對照品溶液，氫溴酸東莨菪堿為0.498 6 mg/mL、硫酸阿托品為0.096 8 mg/mL，分別進樣 1、2、5、10、20 μL，以測得峰面積Y對進樣量X(μg)進行線性回歸。結(jié)果表明，氫溴酸東莨菪堿的進樣量在0.498 6～9.297 2μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，Y=16 122.6+678 293.7X(r=0.999 9);硫酸阿托品的進樣量在0.096 8～1.936 0 μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，Y=33 533.4+826 748.0X(r=0.999 7)。

2.3.3 精密度試驗 精密吸取二者混合對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，在上述色譜條件下重復(fù)進樣6次，以氫溴酸東莨菪堿、硫酸阿托品的峰面積計算RSD(n=6)，分別為0.75%、0.89%。結(jié)果表明，儀器精密度符合要求。

2.3.4 重復(fù)性試驗 分別精密稱取同一批號樣品(批號201109001)適量，共6份，照2.2.1項方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進行分析，東莨菪堿質(zhì)量濃度為20.29 μg/mL，RSD(n=6)為2.36%、硫酸阿托品質(zhì)量濃度為6.91 μg/mL，RSD(n=6)為2.23%。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 回收率試驗 采用加樣回收率法。分別精密量取已知含有量的樣品25 mL(批號201109001，東莨菪堿質(zhì)量濃度為20.29 μg/mL、硫酸阿托品質(zhì)量濃度為6.91 μg/mL)，共6份，精密加入氫溴酸東莨菪堿對照品1 mL(0.464 4 mg/mL，折算成東莨菪堿為0.321 4 mg/mL)及硫酸阿托品對照品1 mL(0.242 4 mg/mL)，按2.2.1項操作，測定并計算供試品中東莨菪堿、硫酸阿托品的回收率，結(jié)果見表1，可見本法回收率較好。

表1 氫溴酸東莨菪堿與硫酸阿托品回收率試驗結(jié)果Tab.1 Results of recoveries for scopolamine hydrobromide and atropine sulfate

2.3.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液 (批號201109001)分別于0、2、4、6、8、10 h內(nèi)進行分析，進樣量10 μL，氫溴酸東莨菪堿、硫酸阿托品峰面積的RSD(n=6)分別為1.77%、1.92%。結(jié)果表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定良好，可滿足檢測時間的需要。

2.3.7 不同色譜柱耐用性 精密稱取同一批號(批號201109001)的樣品，按2.2.1項方法制備供試品溶液，采用DIONEX Acclaim 120 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、依利特 Kromasil C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)、Phenomenex Luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)3種色譜柱在上述色譜條件下進行分析。以氫溴酸東莨菪堿、硫酸阿托品的峰面積計算RSD(n=6)，分別為0.38%、0.56%。結(jié)果表明，3種色譜柱測定結(jié)果精密度良好。

2.4 樣品測定

用HPLC法測定兩種生物堿，并與原標準采用TLC-SCAN法測定氫溴酸東莨菪堿進行比較。結(jié)果見表2。

表2 樣品測定結(jié)果 (μg·mL－1)Tab.2 Results of determination by HPLC and TLC scan(μg·mL－1)

3 討論

，氫溴酸東莨菪堿的HPLC流動相，有甲醇-水［2-3］(40∶60，水中含0.02 mol/L 醋酸鈉、0.02%三乙胺、用冰醋酸調(diào)pH至6.0)、甲醇-水［4］(含 0.025 mol/L庚烷磺酸鈉及 0.05 mol/L醋酸鈉，以醋酸調(diào)pH=4.6)(45∶55)、甲醇-水［5］(53 ∶47，水中含 20 mmol/L 醋酸鈉，0.02%三乙胺，0.3%四氫呋喃，pH為6.86)等，多所選緩沖鹽［6］或離子對系統(tǒng)［7-10］，且對pH均有控制。尚有采用GC法進行測定［11］。本實驗所用流動相系統(tǒng)，所用醋酸鹽及庚烷磺酸鈉，比《中國藥典》2010年版洋金花測定項下磷酸鹽及十二烷基硫酸鈉，更有利于保護色譜柱，并通過實驗確定最佳離子對試劑濃度與適宜pH值。

原標準TLC-SCAN法僅測定氫溴酸東莨菪堿，結(jié)果與HPLC法相比相差近30%，且TLC-SCAN法操作過程誤差較大，斑點顯色后不穩(wěn)定，易褪色，測定波長選擇不合適，故無法控制該產(chǎn)品質(zhì)量。HPLC法可同時測定該制劑中兩種生物堿類成分的量，方法靈敏準確，可控制性強，完全可替代TLC-SCAN法用于控制該產(chǎn)品質(zhì)量。

參考文獻:

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:250.

［2］胡奇志，羅興平.華佗止痛擦劑中氫溴酸東莨菪含量測定方法［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2007，22(9):631-633.

［3］侯士果，谷學(xué)新，王書妍，等.HPLC測定洋金花中東莨菪堿和阿托品的含量［J］.中國中藥雜志，2006，31(13):1065-1067.

［4］盧日剛.反相離子對HPLC法測定暈寧貼膏中氫溴酸東莨菪堿的含量［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報，2004，20(5):341-343.

［5］陸 霞，李 華，阮桂平.心寶丸中硫酸阿托品與氫溴酸東莨菪堿的含量測定［J］.中藥材，2002，25(5):353-354.

［6］侯媛媛，李若潔，彭敏佳，等.HPLC-MS/MS法同時測定華山參滴丸中阿托品、山莨菪堿和東莨菪堿的含量［J］.南開大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2010，43(4):29-35.

［7］孔愛英，張顯杰，陳新善，等.離子對色譜法測定氫溴酸東莨菪堿注射液的含量和降解產(chǎn)物［J］.分析科學(xué)學(xué)報，2003，19(5):429-430.

［8］朱月琴，張 弦，殷放宙.HPLC法測定洋金花及其總生物堿中東茛菪堿的含量［J］.海峽藥學(xué)，2006，18(1):95-97.

［9］卞 俊，蔡定國，顧明娟.反相高效液相色譜法同時測定金馬通絡(luò)膠囊中東茛菪堿及士的寧含量［J］.藥物分析雜志，2000，20(1):48-50.

［10］柴金玲，李 瑛，李 偉，等.HPLC法測定洋金花中東莨菪堿的含量［J］.藥物分析雜志，2006，26(5):634-636.

［11］李永慶，趙 文，朱霽虹.毛細管氣相色譜法測定戒毒藥(康靈片)中微量東莨菪堿的含量［J］.藥物分析雜志，1999，19(4):239-241.