李 瑩， 張慧敏， 何 瑤， 閆 莉， 傅超美

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，四川成都611137)

四逆湯方出自《傷寒論》，由附子、甘草(炙)、干姜組成，是溫腎健脾、回陽固本的經(jīng)典名方［1-2］?，F(xiàn)代研究表明［3-7］，本方對動物腦缺血、休克、腦梗死、心肌梗死等癥候均具有良好的治療效果。湯劑是傳統(tǒng)中醫(yī)最有效及最常用的劑型之一，科學(xué)合理的制備工藝是保證四逆湯質(zhì)量和療效的關(guān)鍵，但目前對四逆湯湯液制備工藝的研究［2，8］尚少，且尚未見對其從化學(xué)成分和藥理作用多角度的綜合分析。本課題前期研究［9］表明從化學(xué)成分角度分析，四逆湯的傳統(tǒng)煎煮法與《中國藥典》(2010年版一部)［1］所載方法相比具一定優(yōu)勢，故本實(shí)驗綜合化學(xué)指標(biāo)和藥效指標(biāo)對傳統(tǒng)煎煮工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

本實(shí)驗基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型模擬的良好特性，在正交設(shè)計所得化學(xué)和藥效兩方面數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，利用BP網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化工藝參數(shù)，以期得到比正交設(shè)計更合理的四逆湯制備工藝，以確保所制備四逆湯的有效性，為本課題的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

Agilent 1200型高效液相色譜儀 (美國Agilent公司);METTLER AE240電子分析天平 (十萬分之一，梅特勒-托利多儀器有限公司);202-2型干燥箱 (上海市實(shí)驗儀器總廠)。

昆明種清潔級健康小鼠100只，雌雄各半，體質(zhì)量 (20±2)g(由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗動物研究所提供，實(shí)驗動物生產(chǎn)許可證編號:SCXK(川)2008-24)。

甘草酸單銨、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿等對照品購自成都曼思特生物科技有限公司，純度均≥98%，批號依次為A0039、MUST-11050502、MUST-11050501、MUST-11050503(供定量測定用);甲醇、乙腈為色譜純(美國Sigma-Aldrich公司);水為超純水;其余試劑均為分析純。生附片 (批號:1202015)購自四川新荷花中藥飲片有限公司，炙甘草 (批號:120408)和干姜 (批號:120205)均購自四川科倫天然藥業(yè)有限公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)盧先明教授鑒定，均符合2010年版《中國藥典》相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 單酯型生物堿 Symmetry Shield RP18色譜柱 (Waters公司，4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流動相A為5 mmol/L醋酸銨溶液 (含0.1%醋酸)，流動相B為乙腈 (含0.1%甲酸)，采用梯度洗脫，梯度程序為0～15 min:25% ～40%B，15～30 min:40%～45%B;檢測波長235 nm;體積流量1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL;理論板數(shù)按苯甲酰新烏頭原堿峰計算不低于3×103。

2.1.2 甘草酸 色譜條件及方法學(xué)考察 均按文獻(xiàn)甘草酸測定［9］的相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行。

2.2 對照品溶液的制備

2.2.1 單酯型生物堿 分別取苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿對照品適量，精密稱定，置50 mL量瓶中，加二氯甲烷-異丙醇(1∶1)混合溶液溶解并定容，配成單酯型生物堿對照品貯備液，其中含苯甲酰新烏頭原堿87.2 μg/mL、苯甲酰烏頭原堿7.0 μg/mL、苯甲酰次烏頭原堿 23.0 μg/mL。

2.2.2 甘草酸 取甘草酸單銨對照品適量，精密稱定，置50 mL量瓶中，加流動相［甲醇－0.2 mol/L醋酸銨溶液 (含0.5%冰醋酸)65∶35］溶解并稀釋至刻度，配置成含甘草酸單銨2.164 mg/mL(即折合甘草酸2.120 mg/mL)的對照品貯備液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 測定單酯型生物堿樣品 稱取生附片150 g、炙甘草飲片150 g和干姜飲片100 g，置圓底燒瓶中，按2.7項下正交設(shè)計的不同工藝參數(shù)制備9組四逆湯溶液，濃縮至200 mL。分別精密吸取5 mL，以10 000 r/min離心15 min，取上清液用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3.2 測定甘草酸樣品 同文獻(xiàn)甘草酸測定［6］的相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取苯甲酰新烏頭原堿和苯甲酰烏頭原堿對照品貯備液0.5、2、4、6、8、10 mL，苯甲酰次烏頭原堿對照品貯備液0.5、2、4、6、8、15于25 mL量瓶中，分別加二氯甲烷-異丙醇 (1∶1)混合溶液稀釋至刻度，配成不同濃度對照品溶液，進(jìn)樣10 μL，在單酯型生物堿色譜分析條件下測定。分別以進(jìn)樣質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積 (A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，單酯型生物堿的回歸方程、r值及線性范圍見表1。

表1 3種單酯型生物堿線性關(guān)系Tab.1 Linear relations test results of the monoester-alkaloids

2.4.2 精密度試驗 分別取單酯型生物堿、甘草酸單銨對照品稀釋液，分別重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量10 μL，依各法測定，記錄峰面積，結(jié)果測得苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿和甘草酸的 RSD分別為0.93%、1.34%、0.65%和0.76%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗 按正交設(shè)計方法制備的9號樣品溶液制備方法，平行制備5份供試品溶液，進(jìn)樣量10 μL，依各法測定，記錄峰面積。結(jié)果計算苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿和甘草酸的RSD分別為1.05%、1.52%、0.87%和1.02%，結(jié)果表明各方法重復(fù)性均良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取按正交設(shè)計方法制備的9號樣品溶液方法制備的供試品溶液，4℃下放置0、2、4、6、8、10 h，進(jìn)樣量 10 μL，依各法測定，記錄峰面積。結(jié)果計算苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿和甘草酸的RSD分別為0.42%、0.78%、0.55%和0.97%。結(jié)果表明樣品溶液在配制后10 h內(nèi)均穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收率試驗 分別稱取6份生附片7.5 g、炙甘草飲片7.5 g和干姜飲片5 g，分成3組，按已知量 (苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿和甘草酸質(zhì)量濃度分別為15.61、2.07、5.40、8.172 mg/mL)分別加入相當(dāng)于0.8、1.0、1.2倍量苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿和甘草酸單銨對照品溶液，按正交9號供試品的方法制備，依各法測定，計算苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿和甘草酸的平均回收率分別為102.63%、95.92%、96.25%和99.46%，RSD分別為1.83%、2.05%、1.37%和1.26%。

2.5 樣品定量測定

分別按正交設(shè)計按不同工藝參數(shù)制備的9組四逆湯溶液，進(jìn)樣量10 μL，依各法測定，記錄峰面積，計算苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿和甘草酸的量，同時考察正交設(shè)計各組制備的四逆湯對小鼠抗腦缺氧能力的影響，并設(shè)灌胃生理鹽水的空白對照組。結(jié)果見表2。

表2 L9(34)正交試驗設(shè)計及結(jié)果(±s，n=10)Tab.2 Design and results of L9(34)orthogonal test(±s，n=10)

表2 L9(34)正交試驗設(shè)計及結(jié)果(±s，n=10)Tab.2 Design and results of L9(34)orthogonal test(±s，n=10)

注:與空白對照組 ［喘氣次數(shù):(11.54±2.33)次，喘息時間:(18.28±2.93)min］比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

序號 A B/h C/次 空列 單酯型生物堿Y1/(μg·mL－1)7.5 3.112 15.13 12.1±2.80 20.69±2.41 2 1(1 ∶6) 2(1.5) 2(2) 2 11.91 4.386 19.56 15.0 ±2.15＊＊ 24.49 ±3.36＊＊3 1(1∶6) 3(2) 3(3) 3 16.25 7.910 24.61 12.9±2.72* 22.80±3.10＊＊4 2(1 ∶8) 1(1) 2(2) 3 14.96 4.490 20.27 15.7 ±2.11＊＊ 24.44 ±1.28＊＊5 2(1 ∶8) 2(1.5) 3(3) 1 25.61 8.278 28.40 14.5 ±3.47＊＊ 22.71 ±3.65＊＊6 2(1 ∶8) 3(2) 1(1) 2 9.66 3.748 17.17 14.9 ±1.28＊＊ 23.20 ±3.50＊＊7 3(1∶10) 1(1) 3(3) 2 21.56 8.564 26.43 13.9±2.64* 21.48±2.27*8 3(1∶10) 2(1.5) 1(1) 3 10.67 4.266 17.59 14.1±2.77* 22.45±2.18＊＊9 3(1∶10) 3(2) 2(2) 1 21.01 8.172 22.63 13.4±2.10* 21.26±3.89*K1 158.39 181.53 121.75 218.62化學(xué) K2 198.72 195.29 193.88 181.78指標(biāo) K3 221.78 202.07 263.26 178.49 R 21.13 6.85 47.17 13.38 K1 266.18 268.80 266.34 259.40藥效 K2 287.26 281.05 283.75 280.71指標(biāo) K3 264.94 268.53 268.29 278.27/min 1 1(1∶6) 1(1) 1(1)1甘草酸Y2/(mg·mL－1)干膏率Y3/%喘氣次數(shù)Y4/次喘息時間Y5 7.44 4.17 5.80 7.10 R

2.6 四逆湯對小鼠抗腦缺氧能力的影響［10-11］

將小鼠隨機(jī)分為10組，不同工藝制備的四逆湯9組，空白對照1組，每組10只，雌雄各半，試驗前禁食12 h，自由飲水。分別單劑量 (0.3 mL/20 g)灌胃四逆湯溶液 (空白對照組灌胃生理鹽水)。連續(xù)給藥3 d，于末次給藥40 min后，用大剪刀在小鼠耳后2 mm處快速斷頭，立即觀察并記錄小鼠腦死亡前張口喘氣次數(shù)及喘息時間。經(jīng)統(tǒng)計，與空白對照組比較，正交設(shè)計各組除第1組以外，均具有顯著性差異 (P＜0.05或P＜0.01)，表明正交設(shè)計各組所制備四逆湯 (第1組除外)均對小鼠急性腦缺氧具有明顯的保護(hù)作用，見表2。

2.7 正交試驗方法與結(jié)果

根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，選擇以料液比 (A)、提取時間 (B)、提取次數(shù) (C)為考察因素，以單酯型生物堿 (即苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿)的質(zhì)量濃度之和、甘草酸的質(zhì)量濃度及干膏收率為化學(xué)指標(biāo)Ya(加權(quán)綜合評分:Ya%=Y1/Y1，Max×60+Y2/Y2，Max× 30+Y3/Y3，Max×10，其中Y1為每個試驗號樣品重復(fù)取樣3次測得單酯型生物堿質(zhì)量濃度和的平均值，Y1，Max為9個樣品中單酯型生物堿質(zhì)量濃度和平均值中的最大值，Y2是每個試驗號樣品重復(fù)取樣3次測得的甘草酸質(zhì)量濃度平均值，Y2，Max為9個樣品中甘草酸質(zhì)量濃度的最大值，Y3為每個樣品的干膏收率，Y3，Max為9個樣品中干膏收率的最大值)，以喘氣次數(shù)和喘息時間為藥效指標(biāo)Yb(加權(quán)綜合評分:Yb%=Y4/Y4，Max× 50+Y5/Y5，Max× 50，其中Y4為每個試驗號樣品組10只小鼠的平均喘氣次數(shù)，Y4，Max為9個樣品組中小鼠喘氣次數(shù)的最大值，Y5為每個試驗號樣品組10只小鼠的平均喘息時間，Y5，Max為9個樣品組中小鼠喘息時間的最大值)進(jìn)行L9(34)正交試驗優(yōu)選最佳工藝條件，正交設(shè)計因素水平見表2。

以化學(xué)指標(biāo) (單酯型生物堿的量、甘草酸的量和干膏收率)和藥效指標(biāo) (喘氣次數(shù)與喘息時間)為指標(biāo)，選用正交試驗設(shè)計進(jìn)行試驗，結(jié)果見表2。由極差分析結(jié)果可知，各因素對化學(xué)指標(biāo)影響的重要性依次為 C＞A＞B;各因素對藥效指標(biāo)的影響的重要性依次為 A＞C＞B。由正交設(shè)計的極差分析結(jié)果得到的最佳制備工藝為A2B2C2或A3B3C3。

2.8 基于正交設(shè)計的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化［12-14］

通過正交設(shè)計優(yōu)化的制備工藝參數(shù)有兩組，為優(yōu)選出最佳的工藝參數(shù)，以正交試驗數(shù)據(jù)為訓(xùn)練樣本，建立人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) (ANN)，并訓(xùn)練該網(wǎng)絡(luò)，再使用該網(wǎng)絡(luò)預(yù)測 (優(yōu)化)工藝參數(shù)。

以正交試驗中每組試驗3個因素的數(shù)值作為輸入，以綜合評分 (化學(xué)指標(biāo)與藥效指標(biāo)之和:Y%=Ya%+Yb%)作為輸出，運(yùn)用 MATLAB(R2010b版本，Math Works，美國)軟件編程，建立前饋人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) (BPNN)。網(wǎng)絡(luò)設(shè)置一個隱含層，含20個神經(jīng)元，采用 Levenberg-Marquardt算法，最大迭代次數(shù)為100次，網(wǎng)絡(luò)計算精度取0.000 1，建立并訓(xùn)練網(wǎng)絡(luò)，很快的得到滿足要求的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。然后依次對3個因素定一個合適的步長，并用3個循環(huán)對每個因素定義域的值進(jìn)行編程，以尋找使輸出值 (綜合評分)最大的組合。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型運(yùn)行的結(jié)果是料液比為1∶8，提取3次，每次1.5 h。

2.9 驗證試驗

稱取生附片150 g、炙甘草飲片150 g和干姜飲片100 g，分別按正交設(shè)計試驗和ANN優(yōu)選的最佳制備工藝參數(shù)、《中國藥典》2010年版一部［1］所載方法分別平行安排試驗，制備四逆湯，依各法分別測定，結(jié)果見表3。

表3 驗證試驗結(jié)果(±s，n=5)Tab.3 Verifying test results(±s，n=5)

表3 驗證試驗結(jié)果(±s，n=5)Tab.3 Verifying test results(±s，n=5)

注:與人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

參數(shù)水平 單酯型生物堿 甘草酸 干膏率 喘氣次數(shù) 喘息時間料液比組別 提取時間/h提取次數(shù)/次質(zhì)量濃度/(μg·mL－1)RSD/%質(zhì)量濃度/(μg·mL－1)RSD/% 得率/% RSD/%次數(shù)/次RSD/%常態(tài)/min RSD/%8.60 1∶10 2 3 24.91±0.19＊＊ 0.76 8.26±0.16 1.95 28.21±0.18 0.65 12.7±1.89＊＊ 14.87 21.00±1.90* 9.06 ANN優(yōu)化 1∶8 1.5 3 25.35±0.34 1.35 8.51±0.20 2.31 28.07±0.36 1.28 15.8±1.48 9.34 23.82±0.97 4.08《中國藥典》方法 2，1.5 2 17.82±0.40＊＊ 2.26 2.52±0.18＊＊ 2.38 6.21±0.15＊＊ 2.41 12.7±1.77＊＊ 13.91 21.39±2.50*正交優(yōu)化 1∶8 1.5 2 21.55± 0.53＊＊ 2.44 7.14±0.13＊＊ 1.83 23.02±0.19＊＊ 0.83 14.3±1.64＊＊ 11.44 22.38±1.93*12.89

結(jié)果顯示，按ANN優(yōu)化的參數(shù)試驗的考察指 標(biāo)均處于較高水平，且重復(fù)性良好;將各組結(jié)果分別與ANN優(yōu)化的結(jié)果進(jìn)行t檢驗 (雙側(cè))，除正交優(yōu)化結(jié)果 (A3B3C3)的甘草酸與干膏率外，其它各組與ANN優(yōu)化的結(jié)果均具有顯著性差異 (P＜0.05或P＜0.01)，表明ANN優(yōu)選的工藝比正交試驗所得工藝更優(yōu)越且穩(wěn)定合理，具有可操作性。

3 討論

目前研究認(rèn)為四逆湯方中的君藥—附子的有效成分為酯型生物堿成分，《中國藥典》2010年版［1］一部附子“含量測定”項對單酯型生物堿 (苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿)的含量進(jìn)行了相關(guān)規(guī)定;《中國藥典》中四逆湯的“含量測定”項對甘草酸的含量進(jìn)行了相關(guān)規(guī)定，故本實(shí)驗選擇單酯型生物堿和甘草酸的含量作為四逆湯有效成分的考察指標(biāo)。同時，本研究還采用RP-HPLC對正交各組樣品所含雙酯型生物堿(新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿)的量進(jìn)行了測定，結(jié)果均符合《中國藥典》的限量規(guī)定。試驗各組制備四逆湯均符合《中國藥典》的相關(guān)規(guī)定，且通過聯(lián)用ANN與正交試驗得到比正交試驗優(yōu)化的工藝更合理的工藝參數(shù)。

分別以化學(xué)指標(biāo)和藥效指標(biāo)的正交設(shè)計試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示各因素均不具顯著性(P＞0.05)，故正交設(shè)計試驗的結(jié)果僅采用極差分析結(jié)果進(jìn)行試驗參數(shù)的優(yōu)選。正交試驗各組 (除第1組外)藥效與空白對照組進(jìn)行數(shù)據(jù)分析均具有顯著性差異，正交試驗方差分析只有因素A(料液比)和 C(提取次數(shù))具一般顯著性 (P＜0.1)，分析四逆湯對小鼠急性腦缺氧的保護(hù)作用與制備工藝參數(shù)只有一般顯著性影響，另藥效試驗部分均屬重復(fù)取樣，正交分析結(jié)果也有所差異。

現(xiàn)代研究顯示，四逆湯對腦細(xì)胞和心肌細(xì)胞缺氧具有較好的改善效果［2-4］。本研究以小鼠全腦缺血-再灌注損傷模型為代表，將小鼠抗急性腦缺氧能力的提高作為四逆湯藥理作用的體現(xiàn)，以保證該制備工藝研究下四逆湯的臨床療效。該藥理模型下，小鼠斷頭后，腦供血中斷，腦內(nèi)殘余的血和營養(yǎng)物質(zhì)可以使腦功能維持一定時間，其表現(xiàn)為離體鼠頭有規(guī)律的張口喘息，故以喘氣時間和喘氣次數(shù)反映小鼠抗急性腦缺氧能力。結(jié)果表明四逆湯正交試驗各組 (第1組除外)對小鼠的急性腦缺氧有明顯的保護(hù)作用。

當(dāng)實(shí)驗有多因素多指標(biāo)時，通過選擇正交設(shè)計、均勻設(shè)計、星點(diǎn)設(shè)計等其中的一種試驗設(shè)計優(yōu)選出的工藝參數(shù)，常需要大量而反復(fù)的工作，優(yōu)選出來的參數(shù)往往是較優(yōu)的而非最佳的。本實(shí)驗正交試驗對制備四逆湯的多指標(biāo)多因素進(jìn)行考察，聯(lián)用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)則恰好地發(fā)揮其以最大的精度逼近非線性函數(shù)模型的優(yōu)勢，最終獲得最符合的實(shí)驗要求的優(yōu)化參數(shù)。

為了減少訓(xùn)練中的計算量和內(nèi)存需求量，本實(shí)驗采用了 Levenberg-Marquardt算法［13］(trainlm)建立神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，因為該函數(shù)很好的利用了MATLAB中對于矩陣的運(yùn)算的優(yōu)勢，對于中等規(guī)模的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)具有最快的收斂速度。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:650.

［2］吳偉康.四逆湯現(xiàn)代研究與應(yīng)用［M］北京:人民衛(wèi)生出版社，2011:117.

［3］商李超，郁保生.四逆湯的藥理作用研究進(jìn)展［J］.中西醫(yī)結(jié)合腦血管病雜志，2009，7(11):1333-1335.

［4］姜之全，陳前芬，田鶴村.四逆湯對小鼠全腦缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用［J］.中國腦血管病雜志，2004，1(12):556-558.

［5］Chen H C，Chen W C，Lin K H，et al.Simultaneous use of traditional Chinese medicine(si-ni-tang)to treat septic shock patients:study protocol for a randomized controlled trial［J］.Trials，2011，12:199.

［6］黨萬太，苗維納，楊曉放，等.去磷酸化NFATc蛋白的相對表達(dá)與四逆湯治療心力衰竭的機(jī)制分析［J］.中藥藥理與臨床，2011，27(4):1-3.

［7］廖火城，劉 勇，周 彬，等.四逆湯對異丙腎上腺素引起的大鼠心肌纖維化和TGF-β1表達(dá)的影響［J］.中國病理生理雜志，2010，26(7)，1316-1320.

［8］凌家俊，周莉玲.四逆湯提取工藝的篩選［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2000，17(2):167-170.

［9］李 瑩，章津銘，傅超美，等.不同方法制備四逆湯中化學(xué)成分對比研究［J］.中成藥，2012，34(4):673-677.

［10］高允生，齊永秀，李 珂.白花丹參莖葉水提物對小鼠缺氧模型的保護(hù)作用［J］.中國中醫(yī)藥科技，2006，13(3):171-172.

［11］顏景峰，李金平，寇俊萍，等.魯斯可皂苷元對小鼠腦缺血缺氧的保護(hù)作用［J］.中藥新藥與臨床藥理，2010，21(4):331-334.

［12］劉海臣，卓金武，吳國光.基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的茶葉咖啡因提取條件的優(yōu)化［J］.應(yīng)用化學(xué)，2007，24(4):457-460.

［13］魏國棟，李夏蘭，王昭晶，等.均勻設(shè)計法優(yōu)化芥菜多糖的提取工藝及其神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32(2):53-56.

［14］聞 新，周 露，李 翔，等.MATLAB神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)仿真與應(yīng)用［M］.北京:科學(xué)出版社，2003.