裴 強， 桑文鳳， 趙習德*

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，河南衛(wèi)輝 453100;2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院，河南新鄉(xiāng) 453000)

由動脈粥樣硬化 (atherosclerosis)所導致的心腦血管疾病是嚴重危害人類健康的一大類疾病，致死率和致殘率居所有疾病之首，有“頭號殺手”之稱。目前對大血管損傷及其機制的研究資料豐富，但對動脈粥樣硬化時微血管的結構和功能改變及其分子機制的研究缺乏相關的文獻資料。有報道基質金屬蛋白-2(MMP-2)參與心臟和動脈重塑［1］，通過下調MMP-2的表達防止心臟擴張，保護心肌收縮力，減輕心肌纖維化［2］。但其與微小血管病變間的關系尚未見報道。本研究通過藥物干預動脈粥樣硬化模型大鼠，檢測其微小血管密度及MMP-2表達的變化，觀察桂枝茯苓膠囊對動脈粥樣硬化時冠脈微小血管的影響及其可能的作用機制。西藥卡托普利［3］和辛伐他汀對動脈粥樣硬化均有良好的防治作用，另有報道認為辛伐他汀有促進缺血心肌毛細血管新生的作用，進而保護缺血心?。?］。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級雄性SD大鼠50只(購于新鄉(xiāng)醫(yī)學院實驗動物中心)，7～8周齡，體質量180～230 g。飼養(yǎng)在新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院中心實驗室。

1.2 主要藥品與試劑 桂枝茯苓膠囊 (江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號:100946);辛伐他汀(北京萬生藥業(yè)有限責任公司，批號:20110114);卡托普利 (上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號:110301);維生素D3針 (上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號:100103);兔抗大鼠平滑肌α-肌動蛋白單克隆抗體、兔抗大鼠層黏素多克隆抗體、兔抗大鼠MMP-2抗體 (北京博奧森生物技術有限公司)。

1.3 造模方法及動物分組 大鼠購回后適應性喂養(yǎng)1周，隨機將大鼠隨機分成兩組。空白組為12只，給予普通飼料喂養(yǎng);造模組為38只，按文獻的方法［5］稍加改進，采用高脂飼料 (配制方法為78.5%普通飼料，1%膽固醇，0.5%豬膽鹽，10%熟牛油，10%蛋黃粉)喂養(yǎng)與維生素D3腹腔注射(實驗第1周，維生素D3700 000 U/kg，分3次注射，間隔2 d)相結合的方法復制大鼠動脈粥樣硬化的模型。兩組均喂養(yǎng)8周后各取2只處死，取血及主動脈，測血脂及病理形態(tài)學觀察，證實造模成功后造模組改為減半高脂的飼料喂養(yǎng)，造模組大鼠隨機分為3組，模型組、西藥對照組、治療組，每組12只。

1.4 藥物干預 造模成功后開始灌胃給藥，時間為6周。藥物灌胃前用生理鹽水配成溶液。模型組及空白組均給予生理鹽水 ［8 mL/(kg·d)］;西藥組給予辛伐他汀 ［0.86 mg/(kg·d)］和卡托普利［4.3 mg/(kg·d)］;治療組給予桂枝茯苓膠囊［0.24 g/(kg·d)］。

1.5 標本采集與制備 各組大鼠禁食、水12 h，0.2%水合氯醛腹腔注射麻醉，心尖取血后快速打開胸腹腔，鈍性剝離升主動脈至髂總動脈分叉處并剪斷，取出帶有胸主動脈的心臟，生理鹽水沖洗后置10%中性甲醛溶液中固定。剪取胸主動脈約0.5 cm，心臟保留左心室及室間隔，取垂直于長軸中1/3組織，用不同濃度乙醇逐級脫水，浸蠟、包埋，切片，厚度5 μm，制備成動脈血管橫切面做HE染色及心臟橫切面做免疫組織化學染色。

1.6 指標檢測 免疫組織化學染色法檢測大鼠心肌微小動脈密度、毛細血管密度及MMP-2的表達。主要流程 (過氧化物酶標記的鏈霉卵白素法，即SP法):切片脫蠟、水化，PBS液浸泡，抗原修復，滴加山羊血清工作液，室溫孵育。滴加稀釋后一抗 (兔抗大鼠)，4℃冰箱過夜。PBS沖洗，滴加生物素化二抗工作液 (生物素標記山羊抗兔)，37℃溫箱孵育。PBS沖洗，滴加辣根酶鏈霉卵白素工作液，37℃溫箱孵育。PBS沖洗，滴加DAB顯色劑，輕度復染細胞核，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察、拍照。大鼠心肌MMP-2陽性表達的測定采用計算機圖像分析系統(tǒng) (Image-Pro plus)，測量其平均光密度 (MOD)。MOD越高，反映該物質表達越強。每只大鼠均觀測6張切片，每張切片隨機選取相等的5個高倍視野 (×400)計算其均值。高倍鏡下直徑小于20 μm的圓形血管，抗平滑肌α-肌動蛋白抗體染色呈棕黃色的是微小動脈;油鏡視野下直徑小于8 μm的單個核標記的血管，抗層黏素抗體染色呈現(xiàn)為藍色的是毛細血管;取10個不同視野下的均值，即是其微小動脈密度與毛細血管密度。

1.7 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差 (±s)來表示。多組間計量資料采用單因素方差分析;相關性檢驗采用Pearson相關分析。P＜0.05為有顯著性差異。

2 結果

2.1 心肌微小動脈密度、毛細血管密度、MMP-2結果 (表1)空白組可見少量、散在的呈現(xiàn)棕黃色圓形的微小動脈 (圖1A)及多個呈現(xiàn)藍色的毛細血管 (圖2A)，模型組可見微小動脈的數(shù)量明顯增多 (圖1B)，毛細血管數(shù)量明顯減少 (圖2B)，微小動脈密度及毛細血管密度與空白組相比有顯著性差異 (P＜0.05)，治療組和西藥對照組微小動脈 (圖1C、1D)及毛細血管 (圖2C、2D)的數(shù)量介于空白組與模型組之間。微小動脈密度及毛細血管密度與模型組相比均有顯著性差異 (P＜0.05)，但治療組與西藥對照組相比均無顯著性差異 (P＞0.05)?？瞻捉M心肌MMP-2僅有較淺黃色著色 (圖3A);模型組可見整個視野呈現(xiàn)較深的黃褐色 (圖3B)，MOD與空白組比較有顯著性差異 (P＜0.05);治療組及西藥對照組呈黃色，治療組染色相對西藥對照組稍淺 (圖3C、3D)，治療組、西藥對照組MOD與模型組相比均有顯著性差異 (P＜0.05)，但兩組間無顯著性差異 (P＞0.05)。

表1 各組大鼠心肌微小動脈密度、毛細血管密度、MMP-2光密度比較 (±s)Tab.1 Comparison of the arteriole and capillay density，optical density of MMP-2 in myocardium among the groups(±s)

表1 各組大鼠心肌微小動脈密度、毛細血管密度、MMP-2光密度比較 (±s)Tab.1 Comparison of the arteriole and capillay density，optical density of MMP-2 in myocardium among the groups(±s)

注:與空白組比較，*P＜0.05;與模型組比較，△P＜0.05。

光密度空白組組 別 動物數(shù)/只 微小動脈密度/(個·mm－2) 毛細血管密度/(個·mm－2) MMP-2 10 16.82±1.55 2 409.74±388.57 0.10±0.02模型組 12 31.64±3.43* 1 491.99±266.58* 0.24±0.03*西藥對照組 12 24.60±2.30＊△ 2 029.52±321.61＊△ 0.17±0.03＊△治療組 12 24.43±1.79＊△ 2 056.67±190.45＊△ 0.16±0.03＊△

圖1 大鼠心肌微小動脈 (免疫組化染色，×400)Fig.1 Arteriole in myocardium in rats in each group(immunohistochemistry staining，×400)

2.2 心肌微小動脈密度、毛細血管密度與MMP-2間相關分析 MMP-2表達與微小動脈密度呈正相關 (r=0.919，P＜0.05)，與毛細血管密度呈負相關 (r=－0.813，P＜0.05)。

3 討論

圖2 大鼠心肌毛細血管 (免疫組化染色，油鏡)Fig.2 Capillary in myocardium in rats in each group(immunohistochemistry staining，oil immersion lens)

心肌功能的正常最終需要微循環(huán)功能的完整性。近90%的心肌血容量位于毛細血管之內，稱為毛細血管血容量［6］。冠脈微血管病變是心肌微小動脈、毛細血管和微小靜脈構成的微循環(huán)系統(tǒng)發(fā)生了結構性改變及功能障礙，是導致冠狀動脈血流儲備下降的關鍵［7］。毛細血管周細胞與微小動脈血管平滑肌細胞相延續(xù)，并被認為隸屬于同一細胞系。某些病理情況下，周細胞可以轉化成為血管的平滑肌細胞［8］，而微小動脈的平滑肌細胞也能夠遷移至下游的毛細血管壁中，從而使毛細血管轉變成微小動脈。

圖3 大鼠心肌MMP-2陽性表達 (免疫組化染色×400)Fig.3 Expression of MMP-2 in rats in each group(immunohistochemistry staining，×400)

冠脈微血管病變屬中醫(yī)“絡病”范疇。病機多由氣血運行不暢，臟腑功能失調，痰阻血瘀絡痹。治療應痰瘀同治。桂枝茯苓膠囊 (桂枝、茯苓、牡丹皮、芍藥、桃仁)具有活血通絡，化瘀消癥功效，治療原則恰合本病病機。文獻報道該方的五味生藥均有抗炎作用，該藥所含的芍藥苷、苦杏仁苷、丹皮酚等有效成分可通過抑制前列腺素E2(PGE2)的合成、增強巨噬細胞的吞噬功能、抑制血小板聚集及血栓素的生成、降低纖維蛋白溶酶的活性、增加外周血流量、促進微血流等作用［9］改善微循環(huán)狀態(tài)。本課題組前期實驗工作也已證實桂枝茯苓膠囊具有保護血管內皮細胞、改善血管舒縮功能、抑制炎癥反應等抗動脈粥樣硬化作用［10］。

MMP-2能特異性降解基底膜 (基底膜的降解是平滑肌細胞遷移和增殖的前提之一)，能增加中性粒細胞與內皮細胞的黏附，觸發(fā)炎性反應，產(chǎn)生的各種致炎因子又能促進MMP-2基因的轉錄和表達，導致毛細血管遭受進一步破壞。MMP-2還能拮抗某些肽類物質的舒張血管效應，與血栓烷素協(xié)同參與縮血管反應，而這些作用進一步加重血管重塑和微小動脈化生，最終導致心肌微小動脈密度增加，毛細血管密度降低［11］，從而使毛細血管血容量下降，冠脈微循環(huán)障礙，心肌缺血。

本研究相關分析顯示MMP-2表達與心肌微血管病變關系密切，拮抗MMP-2表達可能有助于防止心肌微小血管病變。進一步的藥物干預結果顯示:模型組大鼠微小動脈密度明顯增高，毛細血管密度明顯降低，提示模型組出現(xiàn)微小血管病變。而治療組、西藥對照組與模型組相比微小血管病變程度明顯改善。桂枝茯苓膠囊治療組與西藥對照組(辛伐他汀聯(lián)合卡托普利)相比，微小血管病變程度有進一步改善趨勢，但差異尚無統(tǒng)計學意義。提示桂枝茯苓膠囊能通過上調MMP-2表達改善冠脈微小血管異常改變。而這種作用可能是通過抑制血管炎癥反應、保護血管內皮功能等調節(jié)血脂以外的機制。具體發(fā)揮作用的有效成分及更深層次的機制尚待進一步研究。

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