楊熙

1 敗血癥概述

敗血癥是由于致病菌或條件致病菌侵入血液，不斷增殖并產生毒素所引起的臨床綜合征，主要表現(xiàn)為寒戰(zhàn)、高熱、白細胞增加等全身中毒癥狀，嚴重時可見感染性休克、彌散性血管內凝血(DIC)、中毒性腦病、心肌炎等。

細菌的入侵是引發(fā)敗血癥的主要原因。而大腸埃希氏桿菌敗血癥比其他致病菌感染引起的敗血癥更難治愈，常并合中毒性休克和DIC。抗菌藥是臨床治療敗血癥的重要和有效手段。但近年來由于廣譜抗生素不合理使用，各種耐藥菌株相繼產生，許多致病菌對一般的抗生素已經(jīng)不敏感。為增強治療效果，不得不加大抗菌藥物的使用劑量，隨之而來是耐藥性的問題和藥物引發(fā)的毒性反應。另外，抗菌藥雖能一定程度的抑制或殺滅大腸埃希氏桿菌，但對其產生的內毒素不僅沒有明顯的抑制作用，還有資料表明抗生素可誘導內毒素的釋放，而內毒素正是引發(fā)高熱、寒戰(zhàn)等中毒癥狀的重要因素。

2 內毒素及內毒素血癥的概述

內毒素(Et)為革蘭氏陰性菌體表面的一種小分子量的脂多糖(LPS)，是G-細菌胞壁膜層的主要成分，由親水性的多糖、疏水性的類脂A(Lipid A)構成，位于內毒素最外層的0-特異性多糖決定了內毒素的不同菌型具有種屬特異性，其核心多糖和Lipid A(統(tǒng)稱為核心糖脂，CGL)是LPS結構中最穩(wěn)定的部分，無種屬特異性，其中Lipid A是LPS的主要生物活性和毒性成分［1］。

內毒素血癥是由于血中細菌或病灶內細菌釋放出大量內毒素至血液，或輸入大量內毒素污染的液體而引起。分為內源性和外源性兩大類。

目前對內毒素血癥的治療尚缺乏成熟的經(jīng)驗。主動免疫是現(xiàn)代醫(yī)學治療主要采用的方法之一，內毒素核心糖脂疫苗具有生產成本低、可誘導宿主產生高效價內源性抗體等優(yōu)點，能夠在全身性內毒素釋放之前或釋放過程中，刺激機體產生抗體，并在膿毒癥的最初期對機體起防護作用。脫毒LPS疫苗在實驗動物中已顯示出高度的免疫原性和良好的耐受性，其產生的多克隆抗體可結合到一些G-桿菌的LPS核心區(qū)，保護動物免于致死量內毒素攻擊和G-細菌的侵襲性感染［2］?？箖榷舅靥禺愋钥贵w也應用于臨床內毒素血癥的治療，其中，多克隆抗體Rc型的大腸桿菌J5抗血清已被試用于臨床，但對G-細菌膿毒癥的治療效果并不理想;單克隆抗體:目前僅有2株-即E5與HA.1A已完成敗血癥治療的臨床應用研究，但效果不佳。LPS在體內的作用依賴于LBP的存在。LPS進入血循環(huán)后與內毒素結合蛋白(LBP)結合。LBP存在于正常血清中，在感染的急性相反應中其濃度增高100倍。完整的細菌膜上的LPS與LBP結合后將增強嗜中性粒細胞、單核巨噬細胞對它的調理和清除游離的LPS與LBP結合后形成LPS-LBP復合物，它的受體是巨噬細胞的分化抗原CD14分子，在與受體結合后將進一步傳遞細胞內信號而將炎癥放大。這些LPS作用的經(jīng)路也正是其可能的阻斷點。而當代生物技術如細胞工程、基因工程都為此提供了可能性。實驗發(fā)現(xiàn)預防性給予抗LBP抗體能保護小劑量內毒素的損害，但不能改善大劑量內毒素造成的損傷。

3 多器官功能失常(MODS)

MODS是指機體在受到嚴重創(chuàng)傷、休克、感染、大面積燒傷等急性損害24 h后，同時或序貫出現(xiàn)2個或2個以上的系統(tǒng)或器官功能障礙或衰竭，即急性損傷患者多個器官功能改變不能維持內環(huán)境穩(wěn)定的臨床綜合征，臨床上以感染性病因最為多見。感染性MODS更多的是由革蘭陰性菌感染，造成內毒素血癥或內毒素休克，由此引發(fā)機體一系列病理變化，如凝血功能障礙，機體代謝紊亂，微循環(huán)障礙等。DIC是感染性MODS病理變化中的一個重要組成部分。

許多MODS患者有腹腔化膿性感染或其他嚴重感染，其中尤以革蘭陰性菌感染為主。革蘭陰性菌內毒素以結構命名也稱脂多糖(LPS)，是MODS的主要病因之一。

4 卵黃抗體及其應用

卵黃免疫球蛋白(IgY)99%以上存在于蛋黃中，統(tǒng)稱為卵黃抗體。目前研究較多的是雞蛋黃抗體。在雞所產蛋的蛋黃中富含大量來源于血清的免疫球蛋白抗體IgG。雞在受抗原刺激后7～10 d，其蛋黃中就有抗體產生，大約在20 d到達高峰。且其含里遠高于血清。然后逐步下降。再次抗原刺激又會產生一個新的高峰一只雞可獲高特異性的免疫球蛋白抗體IgG長達28周。

IgY抗體與IgG抗體比較類似，但它們在結構上還是有一些明顯的區(qū)別，見圖1.1。IgY的分子量約180 kDa，由兩條輕鏈和兩條重鏈組成(2 h+2L)，其中輕鏈(L)分子量約22 kDa，重鏈分子量約67 kDa，等電點接近5.2。而哺乳動物IgG的重鏈分子量約50kDa，IgY更大的分子量是由于重鏈上恒定結構域和糖鏈的增加。并且，與哺乳動的IgG相比，IgY的鉸鏈區(qū)的彈性更小。IgY結構雖然和IgG不同，但它仍具有免疫活性，且抗體活性很高。IgY的性質較穩(wěn)定，活性保持良好。

圖1 IgY和IgG的分子結構比較

低于75℃條件下，IgY具有良好的熱穩(wěn)定性，高于80℃，大部分IgY喪失結合活性。此外IgY的酸堿穩(wěn)定性較好，在pH＜4時，有部分IgY失活，pH為4～12，活性幾乎不受影響，在pH＞12時迅速失活。并且IgY對胃蛋白酶有較好的抵抗力，但是對胰蛋白酶十分敏感［3］。

表1 IgY和IgG穩(wěn)定性的比較

研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)用特定的抗原免疫產蛋母雞后，母雞可產生對抗原的持久性應答，抗體在卵黃中出現(xiàn)的時候較在血清中出現(xiàn)晚一周左右，但蛋黃中的抗體含量超過血清，從蛋黃中可不斷的獲得特異性的多克隆抗體，由于其抗體來自同一個體，在抗體的均一性上，類似于單克隆抗體，這就克服了多克隆抗體大量制備的限制因素。

IgY不與金黃色葡萄球菌A蛋白結合，不與類風濕因子發(fā)生非特異性反應，對哺乳動物補體無固定作用，因而在檢測診斷中特異性強，靈敏度高。

目前，利用特異性卵黃免疫球蛋白作為被動免疫性藥物防治人畜病毒和細菌性疾病有很多成功的例子［4］。國內外大量文獻證明，卵黃抗體(IgY)作為一大類藥物具有重大的實用價值和良好的應用前景。

5 酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測抗體原理

為了生產雞的特異性IgY用于免疫學檢測，須檢測卵黃中特異性IgY的效價。通常采用間接ELISA測定抗血清、抗體效價。ELISA是以免疫學反應為基礎，將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合起來的一種敏感性很高的試驗技術。在實際應用中，通過不同的設計，具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測抗體的間接法、用于檢測抗原的雙抗體夾心法以及用于檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等。

圖2 間接法ELISA示意圖

本實驗中主要采用間接法，測定IgY抗體的效價。其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測與固相抗原結合的受檢抗體，故稱為間接法，如圖2所示。

操作步驟如下:1)將特異性抗原與固相載體聯(lián)結，形成固相抗原。洗滌除去未結合的抗原及雜質。2)加稀釋的受檢血清，保溫反應。血清中的特異抗體與固相抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去。3)加酶標抗抗體。固相免疫復合物中的抗體與酶標抗體結合，從而間接地標記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與標本中受檢抗體的量正相關。4)加底物顯色本法主要用于對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。間接法成功的關鍵在于抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結果，但應盡可能予以純化，以提高試驗的特異性［5］。

研究特異性抗體對大腸桿菌引起的小鼠敗血癥及內毒素血癥的保護作用，對IgY的臨床應用奠定基礎，以尋找治療敗血癥及內毒素血癥的抗生素替代品具有重大的意義。

［1］常山，查曉霞，嚴小虎.內毒素血癥的抗體治療進展.西南國防醫(yī)藥，2004，14(3):330-332.

［2］麻麗，劉友生.抗內毒素治療的研究現(xiàn)狀.中華燒傷雜志，2003，19(3):190-192.

［3］王炯.雞卵抗體(IgY)理化特性的研究.中國生物制品學雜志，1997，10(3):140-143.

［4］王宇，甄宇紅，郭潔.抗奶牛乳腺炎特異性卵黃抗體的制備及活性檢測.遼寧師范大學學報，2006，29增刊:90-91.

［5］蔣成淦.酶聯(lián)免疫吸附測定法.北京人民衛(wèi)生出版社，1984:102.