劉 丹，楊 莉，張 萍，羅飛華

（四川文理學(xué)院 化學(xué)與化學(xué)工程系，四川 達(dá)州 635000）

1 引言

量子點(diǎn)（quantum dots，QDs）又稱半導(dǎo)體納米晶（semiconductor nanocrystal），通常是由IIB－VIA族或IIIB－VA族原子構(gòu)成的，粒徑尺寸在1～10nm之間的納米顆粒，具有獨(dú)特的物理和化學(xué)性質(zhì)。最近幾年以來(lái)，量子點(diǎn)被用作生物探針的研究備受國(guó)內(nèi)外科研工作人員的廣泛關(guān)注，目前研究較多的是CdX（X＝S、Se、Te）QDs，最有前途的應(yīng)用領(lǐng)域是在生物體系測(cè)定中作為熒光探針。相比于有機(jī)熒光分子，用QDs標(biāo)記細(xì)胞、蛋白質(zhì)和核酸等具有更好的熒光特性，它的相關(guān)應(yīng)用研究，將促進(jìn)超靈敏度、高穩(wěn)定性以及長(zhǎng)發(fā)光壽命的生物檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展[1]。

鮭精蛋白（Salmine，Sal）是鮭魚精子中發(fā)現(xiàn)的一種魚精蛋白，它是一種天然存在于鮭魚成熟精細(xì)胞組織中、與DNA緊密結(jié)合在一起的一種32個(gè)氨基酸殘基的陽(yáng)離子肽，顯強(qiáng)堿性，等電點(diǎn)為12.1，其中精氨酸成分極高，近年來(lái)，Sal在醫(yī)療衛(wèi)生和食品行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景[2]，目前用CdTe QDs作探針共振瑞利散射法研究Sal的方法還未見報(bào)道[3]。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

儀器：Hitachi F－2500型熒光分光光度計(jì)（日本島津），測(cè)定參數(shù)：狹縫寬度5nm；pHS－3C型精密酸度計(jì)（中國(guó)上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

試劑：?jiǎn)钨|(zhì)碲（Te，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），氯化鎘（CdC12·2.5H2O，上海試劑二廠），硼氫化鈉（NaBH4，天津市環(huán)威精細(xì)化工有限公司），巰基乙酸（C2H4O2S簡(jiǎn)寫TGA，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，AR），氫氧化鈉（NaOH，1mol·L－1），硫酸（H2SO4，0.5mol·L－1）Britton－Robinson（BR）緩沖溶液。BR緩沖溶液：用0.2NNaOH 溶液和0.04NH3PO4，H3BO3和HAc溶液按一定的比例混合后，配成不同pH值的緩沖溶液，并用酸度計(jì)校正其pH值。其余試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

2.2 TGA－CdTe QDs的合成

選用50mL三頸燒瓶，通入N2作為保護(hù)氣，攪拌，將0.0194g Te粉溶于10mL蒸餾水中，加入適量NaBH4，一段時(shí)間后，黑色Te粉消失，瓶?jī)?nèi)溶液變得無(wú)色澄清透明，制得NaHTe溶液，備用[4]。

在250mL三頸瓶中加入0.0687g CdCl2·2.5H2O溶液，N2做保護(hù)氣，攪拌，加入0.05mL的巰基乙酸，用1mol·L－1的 NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為11.5，然后向制得的NaHTe溶液中在適當(dāng)攪拌速度下緩慢注入一定量的0.5mol·L－1的 H2SO4，并將生成的H2Te氣體用N2載入到CdCl2溶液中，直至顏色穩(wěn)定不變。升溫至95℃ ，反應(yīng)回流6h后得到橙黃色液體，即得TGA－CdTe QDs溶液（2×10－3mol／L）。

2.3 測(cè)定方法

選用10.0mL的比色管，依次加入2×10－3mol·L－1CdTe QDs1.5mL、pH 值為8.0BR緩沖液1.0mL和適量Sal樣品溶液，用水稀釋至10.0mL，搖勻，靜置，室溫下反應(yīng)10min，在熒光分光光度計(jì)上選擇以λex＝λem，在220～800nm范圍內(nèi)進(jìn)行同步掃描，狹縫寬度為5nm，獲得RRS光譜，在最大共振瑞利散射峰（λmax）處測(cè)定體系的RRS強(qiáng)度IRRS和試劑空白的RRS強(qiáng)度I0，且ΔIRRS＝IRRS－I0。

3 結(jié)果與討論

3.1 CdTe QDs－Sal體系的RRS光譜

圖1為CdTe QDs與Sal相互作用的共振散射光譜，當(dāng)CdTe QDs或Sal單獨(dú)存在時(shí)，它們各自的散射強(qiáng)度（RRS）都很弱；當(dāng)兩者同時(shí)存在時(shí)，二者結(jié)合形成新的結(jié)合物，RRS光譜顯著增強(qiáng)，如圖2中的CdTe QDs－Sal體系的RRS光譜所示，其最大散射峰位于312nm。

圖2 CdTe QDs－Sal體系的熒光光譜

圖1為CdTe QDs－Sal體系的散射光譜，由圖1可知，當(dāng)TGA－CdTe QDs與Sal結(jié)合時(shí)，散射明顯增強(qiáng)，且散射強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)隨Sal濃度的增大而成線性增強(qiáng)，可以用于Sal的定量檢測(cè)。

3.2 CdTe QDs－Sal體系的熒光光譜

從圖2可以看出，QDs與Sal相互作用后，Sal能夠猝滅QDs的熒光，并且QDs的熒光強(qiáng)度隨著鮭精蛋白濃度的增大而逐漸減弱，同時(shí)伴隨著熒光發(fā)射峰位有規(guī)律地紅移。

3.3 體系適宜的反應(yīng)條件

3.3.1 酸度的影響

通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定了CdTe QDs－Sal體系的最佳反應(yīng)條件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，選擇BR緩沖溶液做介質(zhì)時(shí)，實(shí)驗(yàn)效果最佳，最佳的pH值范圍為7.5～8.5，用量為0.6～1.2mL，實(shí)驗(yàn)選用1.0mL的pH值為8.0的BR緩沖溶液來(lái)調(diào)節(jié)體系酸度。

3.3.2 TGA－CdTe QDs濃度的影響

實(shí)驗(yàn)研究了CdTe QDs用量對(duì)體系RRS強(qiáng)度的影響，結(jié)果表明：CdTe QDs溶液適宜用量為1.2～1.6 mL，CdTe QDs的用量過(guò)量或不足都將會(huì)影響實(shí)驗(yàn)效果，實(shí)驗(yàn)確定CdTe QDs的最佳用量為1.5mL（CdTe QDs濃度為2×10－3mol·L－1）。

3.3.3 反應(yīng)時(shí)間的影響

實(shí)驗(yàn)測(cè)定了在不同的反應(yīng)時(shí)間，體系的RRS強(qiáng)度。在室溫下，按實(shí)驗(yàn)方法將各試劑加完混勻后，該體系的ΔIRRS從反應(yīng)開始逐漸增強(qiáng)，在10min后反應(yīng)完全，2h之內(nèi)散射強(qiáng)度基本保持穩(wěn)定，故實(shí)驗(yàn)選在反應(yīng)完畢放置10min后立即進(jìn)行測(cè)量。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在最佳反應(yīng)條件下，以不同濃度的鮭精蛋白與CdTe QDs反應(yīng)，10min后在最大波長(zhǎng)處測(cè)量CdTe QDs－Sal體系的 RRS強(qiáng)度（IRRS），求出散射強(qiáng)度（ΔIRRS）后，以ΔIRRS對(duì)鮭精蛋白濃度作圖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍為：0.016～2.4μg／mL，線性方程：ΔI ＝233.25＋947.54C，相關(guān)系數(shù)為0.9969，檢出限為5.00 ng／mL。

3.5 共存物質(zhì)的影響

在鮭精蛋白濃度為2.5μg·mL－1時(shí)，相對(duì)誤差為10%范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)考察了一些常見干擾物質(zhì)對(duì)鮭精蛋白的影響，結(jié)果如表1所示。其中糖類對(duì)體系的影響較小，允許濃度較大；部分無(wú)機(jī)離子對(duì)體系的影響也較小，允許濃度較大；由于實(shí)驗(yàn)是在堿性環(huán)境中進(jìn)行的，某些金屬離子允許濃度較小，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)使用掩蔽劑，減小其對(duì)體系的影響。

表1 CdTe QDs－Sal體系共存物質(zhì)的影響（CSal＝2.5μg·mL－1）

3.6 RRS增強(qiáng)的原因

3.6.1 分子體積增大

眾所周知分子體積的增大直接影響到散射強(qiáng)度的提高[5]。在弱堿性的緩沖溶液中帶正電的sal和帶負(fù)電的巰基乙酸修飾的量子點(diǎn)通過(guò)靜電引力和氫鍵結(jié)合在一起。隨著聚集到量子點(diǎn)表面的sal的量增多而使量子點(diǎn)的表面帶正電，這樣量子點(diǎn)又結(jié)合另一個(gè)帶有正電的量子點(diǎn)而最終導(dǎo)致量子點(diǎn)的聚集，導(dǎo)致分子體積的增大，RRS顯著增強(qiáng)。

3.6.2 CdTe QDs與鮭精蛋白共振增強(qiáng)散射效應(yīng)

當(dāng)Rayleigh散射的波長(zhǎng)位于分子的吸收帶的附近時(shí)，散射強(qiáng)度將急劇增大，這種現(xiàn)象即為共振瑞利散射。由實(shí)驗(yàn)知，產(chǎn)生增強(qiáng)的瑞利散射效應(yīng)。

3.6.3 疏水性增強(qiáng)

反應(yīng)前，帶負(fù)電荷的CdTe QDs和帶正電荷的鮭精蛋白均有較好的親水性，它們?cè)谒芤褐幸仔纬伤衔?，因而RRS均很微弱。而當(dāng)CdTe QDs與鮭精蛋白結(jié)合后，形成的聚合物成電中性，導(dǎo)致疏水性增加，從而可能形成一種疏水的液—固界面與水形成一種固—液界面，這種界面的形成有利于RRS光譜增強(qiáng)[6]。

3.7 熒光猝滅的原因

在弱堿性條件下，帶負(fù)電的CdTe QDs與帶正電的鮭精蛋白通過(guò)靜電引力及疏水作用力相互作用，導(dǎo)致QDs的熒光猝滅[7]。由CdTe QDs與鮭精蛋白相互作用的熒光光譜和RRS光譜得知，向CdTe QDs溶液中加入一定量的鮭精蛋白后，兩者結(jié)合形成大的結(jié)合物，這種結(jié)合物使得QDs的熒光猝滅，同時(shí)伴隨著發(fā)射峰位的紅移。從紫外光譜圖4也可以看出，鮭精蛋白與QDs之間存在著強(qiáng)烈的相互作用，結(jié)合后有新的吸收峰形成。由此可以說(shuō)明，在pH值為8的弱堿性條件下，帶正電的鮭精蛋白與帶負(fù)電的CdTe QDs通過(guò)靜電引力及疏水作用力結(jié)合，形成不發(fā)光的結(jié)合物，導(dǎo)致QDs的熒光猝滅，其猝滅方式屬于靜態(tài)猝滅。

4 結(jié)論

本文用巰基乙酸作為穩(wěn)定劑，合成了水溶性TGA－CdTe QDs。在弱堿環(huán)境中，用巰基乙酸做穩(wěn)定劑修飾的帶負(fù)電的CdTe QDs與帶正電的鮭精蛋白通過(guò)靜電引力及疏水作用力結(jié)合，形成粒徑較大的結(jié)合物，引起RRS光譜的顯著增強(qiáng)和熒光的猝滅。在一定的條件下，RRS光譜的強(qiáng)度與鮭精蛋白的濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。本文研究了鮭精蛋白和CdTe QDs相互作用的RRS光譜、適宜的反應(yīng)條件和影響因素，通過(guò)RRS光譜、熒光光譜、紫外吸收光譜，研究了CdTe QDs與鮭精蛋白的相互作用機(jī)理，由此建立一種以CdTe QDs作探針共振瑞利散射法快速靈敏檢測(cè)鮭精蛋白的新方法。

[1]Liu Z W，Liu S P，Wang L，et al.Resonance Rayleigh scattering and resonance non－linear scattering method for the determination of aminoglycoside antibiotics with water solubility CdS quantum dots as probe[J].Spectrochim Acta A，2009，74（1）：36～41.

[2]魯健章，王春曉，劉承初，等.鮭精蛋白基因工程菌高效表達(dá)條件的優(yōu)化[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2007，12，28～31.

[3]高 陽(yáng)，畢紹丹.蛋白質(zhì)與玫瑰桃紅R共振瑞利散射的研究及應(yīng)用[J].廣東微量元素科學(xué)，2009，7（16）：21～24.

[4]Deng D W，Yu J S，Pan Y.Water－soluble CdSe and CdSe／CdS nanocrystals：A greenersynthetic route[J].J Colloid Interface Sci，2006，299：225～232.

[5]Liu S P，Luo H Q，Li N B，et al.Resonance rayleigh scattering study of the Interaction of Heparin with some basic diphenyl naphthylmethane dyes [J].Anal Chem，2001，73（16）：3907～3914.

[6]劉紹璞，蔣治良，孔 玲，等.[HgX]納米微粒的吸收光譜、Rayleigh散射和共振Rayleigh散射光譜[J].中國(guó)科學(xué)（B輯），2002，32（6）：554～560.

[7]張 毅.單質(zhì)碘對(duì)水溶性CdTe量子點(diǎn)的熒光猝滅研究[J].光譜實(shí)驗(yàn)室，2009，4（26）：974～978.