申玉超，于曉玲，張秀梅

遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州 121001

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是眾多心腦血管疾病共同的病理基礎(chǔ)，嚴(yán)重危害人類健康。近年來內(nèi)皮損傷學(xué)說得到了多數(shù)學(xué)者支持，內(nèi)皮功能不全被認(rèn)為是AS發(fā)生機(jī)制中的始動(dòng)環(huán)節(jié)，因而對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷進(jìn)行藥物干預(yù)治療，也成為心血管疾病領(lǐng)域研究的一個(gè)新的趨勢(shì)[1]。Lee等[2]激活內(nèi)皮細(xì)胞的Wnt/β-連環(huán)蛋白(Wnt/β-catenin)信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，單核細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮的黏附性增強(qiáng)，但內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)并未增加，因此推斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路可能與AS的發(fā)生機(jī)制有關(guān)[3-4]。本文通過研究阿托伐他汀對(duì)氯化鋰誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Wnt信號(hào)通路相關(guān)因子Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白表達(dá)的影響，探討AS與Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)系及阿托伐他汀抗AS的可能機(jī)制。

材料和方法

1 材料和試劑 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)購(gòu) 自 ATCC公司；胎牛血清、1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自?？寺∩镉邢薰?北京)；Licl購(gòu)自北京協(xié)生生物科技有限公司；阿托伐他汀原粉購(gòu)自輝瑞公司；兔抗人Wnt1抗體購(gòu)自巴傲得生物科技有限公司；鼠抗人β-catenin抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗人dvl1抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；NO試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與分組 HUVECs的培養(yǎng) 用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，體積分?jǐn)?shù)5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，1~2 d換液1次。以0.25%胰蛋白酶消化及傳代，并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、選擇生長(zhǎng)良好的4~6代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分為3組：1)空白對(duì)照組：細(xì)胞不加任何干預(yù)；2)Licl組：加入終濃度為20 mmol/L的Licl；3)阿托伐他汀組：加入終濃度為20 mmol/L的Licl+10 μmol/L的阿托伐他汀共同處理。各組經(jīng)卵育24 h后，收集細(xì)胞及培養(yǎng)的上清液，觀察不同組Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白的表達(dá)及培養(yǎng)液中NO含量的變化。

3 HUVECs形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡觀察各組處理24h后HUVECs的形態(tài)學(xué)變化。

4 HUVECs的NO含量 用硝酸還原酶特異性將NO3-還原NO2-，通過顯色深淺測(cè)定其濃度高低。吸取各組中的細(xì)胞培養(yǎng)液，按南京建成生物工程研究所的試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。

5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)蛋白的表達(dá) 將第4代細(xì)胞接種在有蓋玻片(多聚賴氨酸處理好)的6孔板中進(jìn)行細(xì)胞爬片。4 ℃10%甲醛固定30 min，30%H2O21份+純甲醇9份室溫浸泡15 min，封閉液37 ℃孵育30 min，加兔抗人Wnt1、鼠抗人β-catenin、兔抗人dvl-1抗體(1∶600)于4 ℃過夜;加二抗A液37 ℃卵育30 min，加二抗B液37 ℃孵育30 min，顯色、復(fù)染。以上每步之間用PBS沖洗3次，每次4 min；顯色、復(fù)染，脫水、封片。鏡下觀察蛋白表達(dá)。

6 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，超聲裂解細(xì)胞，4 ℃ 1 000 g離心2 min，取上清液，用考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量。取20 μl蛋白質(zhì)樣品行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別滴加兔抗人Wnt1、鼠抗人β-catenin、兔抗人dvl-1(1∶400)抗體，4 ℃孵育過夜，相應(yīng)堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，堿性磷酸酶法顯色。于掃描儀上成像，并用GENE GENIUS軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度值半定量進(jìn)行分析。以肌動(dòng)蛋白(β-actin，分子量為43 kU)為內(nèi)參照，Wnt1(分子量為40 kU)、β-catenin(分子量為92 kU)及dvl-1(分子量為76 kU)與β-actin條帶灰度值的比值代表各蛋白表達(dá)的相對(duì)量。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用-x±s表示，組間差異采用單因素方差分析，組間兩兩差異采用SNK檢驗(yàn)。P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 倒置顯微鏡觀察各組的形態(tài)學(xué)變化

圖2 免疫組化法檢測(cè)各組Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白表達(dá) A：Wnt1抗體； B：β-catenin抗體； C：dvl-1抗體

結(jié) 果

1 HUVECs形態(tài)學(xué)觀察 對(duì)照組細(xì)胞倒置顯微鏡下呈單層鋪路石狀鑲嵌排列，互不重疊，細(xì)胞邊界清晰，呈多角形；Licl組細(xì)胞收縮變圓，細(xì)胞間隙增寬，邊界不清，部分細(xì)胞脫落；阿托伐他汀組細(xì)胞間隙較Licl組窄，細(xì)胞形態(tài)趨于對(duì)照組。見圖1。

2 各組HUVECs的NO含量比較 與對(duì)照組比較，Licl組及阿托伐他汀組細(xì)胞培養(yǎng)的上清液中一氧化氮含量顯著減少(P＜0.01)；與Licl組比較，阿托伐他汀組細(xì)胞培養(yǎng)的上清液中一氧化氮含量顯著減少(P＜0.01)。見表1。

3 各組Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白表達(dá) 利用免疫組化法檢測(cè)，對(duì)照組Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色淡染顆粒；與對(duì)照組比較，Licl組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量棕色顆粒聚集、濃染；阿托伐他汀組較對(duì)照組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)較多棕黃色顆粒，但較Licl組棕黃色顆粒明顯少。見圖2。利用Western blot法檢測(cè)，與對(duì)照組相比，Licl組和阿托伐他汀組Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白定量明顯上升(P＜0.01)；與Licl組相比，阿托伐他汀組Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白定量明顯降低(P＜0.01)。見表1、圖3。

表1 各組HUVECs的NO含量及Wnt1，β-catenin，dvl-1表達(dá)的比較, n=6)

表1 各組HUVECs的NO含量及Wnt1，β-catenin，dvl-1表達(dá)的比較, n=6)

aP＜0.01，與對(duì)照組相比較；bP＜0.01，與Licl組相比較

?

圖3 Western blot法檢測(cè)各組HUVECs的Wnt1，β-catenin， dvl-1蛋白表達(dá)電泳圖

討 論

Wnt信號(hào)通路至少分為3個(gè)分支[5]：經(jīng)典Wnt信號(hào) 通路(Wnt/β-catenin信號(hào)通路)，Wnt/JNK信號(hào)通路，Wnt/Ca2+信號(hào)通路。通過上述途徑影響細(xì)胞的增殖，分化及凋亡。本研究主要探討Wnt/β-catenin信號(hào)通路，正常情況下此通路處于關(guān)閉狀態(tài)，當(dāng)被激活時(shí)Wnt蛋白表達(dá)增多，與其受體卷曲蛋白(frizzled)結(jié)合，激活dvl-1，使糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)活性受抑制，胞內(nèi)β-catenin水平升高，入細(xì)胞核識(shí)別淋巴樣增強(qiáng)因子/白細(xì)胞增強(qiáng)因子(Tcf/Lef)[6-7]。β-catenin入細(xì)胞核形成Tcf-β-catenin復(fù)合物，它可與鈣黏蛋白啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，從而下調(diào)鈣黏蛋白的表達(dá)[8]。鈣黏蛋白表達(dá)減少，使內(nèi)皮細(xì)胞間黏附功能下降，細(xì)胞間縫隙形成、通透性增加，從而導(dǎo)致炎癥細(xì)胞侵入血管內(nèi)皮下致AS形成。有報(bào)道證實(shí)了Wnt/β-catenin信號(hào)通路在內(nèi)皮細(xì)胞黏附連接重建中居于重要地位[9-10]。Lee等[2]激活內(nèi)皮細(xì)胞的Wnt/β-catenin信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，單核細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮的黏附性增強(qiáng)，但內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)并未增加。綜上推斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活與AS的形成有關(guān)。

阿托伐他汀是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HUG-CoA)還原酶選擇性抑制劑，是廣為應(yīng)用的他汀類藥物，其除有降脂作用外，還具有獨(dú)特的心血管疾病防治作用。Haidari等[11]發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣黏蛋白酪氨酸磷酸化保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附功能。

本研究通過Wnt信號(hào)通路激活劑Licl誘導(dǎo)HUVECs，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌的NO明顯減少，同時(shí)Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白表達(dá)明顯升高，證明在這一過程Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活。在Licl誘導(dǎo)HUVECs的同時(shí)加入阿托伐他汀，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌的NO明顯增加，同時(shí)Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白表達(dá)明顯降低，證明在這一過程Wnt/β-catenin信號(hào)通路被抑制。本研究證實(shí)了Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活可能與AS的形成有關(guān)，而阿托伐他汀抗AS可能與其抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。

1 Schwartz BG, Economides C, Mayeda GS， et al. The endothelial cell in health and disease ： its function， dysfunction， measurement and therapy［J］. Int J Impot Res， 2010， 22（2）： 77-90.

2 Lee DK， Nathan Grantham R， Trachte AL， et al. Activation of the canonical Wnt/beta-catenin pathway enhances monocyte adhesion to endothelial cells［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2006， 347（1）： 109-116.

3 Marinou K， Christodoulides C， Antoniades C， et al. Wnt signaling in cardiovascular physiology. Trends Endocrinol Metab. 2012. [Epub ahead of print] .

4 Mill C， George SJ. Wnt signalling in smooth muscle cells and its role in cardiovascular disorders［J］. Cardiovasc Res， 2012， 95（2）：233-240.

5 Rao TP， Kühl M. An updated overview on Wnt signaling pathways：a prelude for more［J］. Circ Res， 2010， 106（12）： 1798-1806.

6 Miller JR. Wnt signal transduction［M］. London：Nature publishing Group，2002：195-208.

7 Miller JR， Hocking AM， Brown JD， et al. Mechanism and function of signal transduction by the Wnt/beta-catenin and Wnt/Ca2+ pathways［J］. Oncogene， 1999， 18（55）： 7860-7872.

8 Birchmeier W. Cell adhesion and signal transduction in cancer.Conference on cadherins， catenins and cancer［J］. EMBO Rep，2005， 6（5）：413-417.

9 Van Gijn ME， Daemen MJ， Smits JF， et al. The wnt-frizzled cascade in cardiovascular disease［J］. Cardiovasc Res， 2002， 55（1）：16-24.

10 Kuroda J， Nakamura M， Yoshida M， et al. Canonical Wnt signaling in the visceral muscle is required for left-right asymmetric development of the Drosophila midgut［J］. Mech Dev， 128（11-12）： 625-639.

11 Haidari M， Zhang W， Chen Z， et al. Atorvastatin preserves the integrity of endothelial adherens junctions by inhibiting vascular endothelial cadherin tyrosine phosphorylation［J］. Cell Res， 2012，318（14）： 1673-1684.