張 楨，楊躍煌，孫幫燕

1.昆明市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科/昆明醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650028 2.大理學(xué)院藥學(xué)院，云南 大理 671000

脂溶性維生素A是人類機(jī)體維持正常代謝和機(jī)能的必需物質(zhì)，對(duì)兒童骨骼、視力發(fā)育、粘膜生長和生殖功能影響尤為重要，測(cè)定兒童血漿中脂溶性維生素A的濃度，不僅可以了解脂溶性維生素A營養(yǎng)狀況，而且可以為合理補(bǔ)充脂溶性維生素 A提供依據(jù)［1－5］。

1 儀器及試劑

Waters－ACQUITY－UPLC超高效液相色譜儀(Waters，美國)，Empower數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，Sar－torius BT125D電子天平(德國賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，MULTIFUGE X1R超高速離心機(jī)(Thermo，美國)，XW－80A渦旋混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)。

對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào):100138－200603);甲醇:色譜純(美國Fisher公司);水:自制超純水，水機(jī)(PURELAB ELGA公司，英國)。

2 色譜條件 色譜條件:色譜柱為BEH C18柱(50 mm×2.1

3 樣品測(cè)定

3.1 儲(chǔ)備液的配制 取Vitamin A對(duì)照品約5mg，精密稱定，置50ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得濃度約為1000 mg·L－1的儲(chǔ)備液。

3.2 血樣預(yù)處理:取血漿200μl，加入140μl甲醇和異丙醇(v/v，8:2)，渦旋30s后，加入1000ul正已烷，渦旋1min，室溫高速離心2min(12000×g)，取上清液700μl，吹干后甲醇 100 μl復(fù)溶。

4 線性關(guān)系和線性范圍

取空白血漿200μl共6份，分別加入不同濃度Vitamin A 50μl，配成濃度為 50，100，200，400，800，1000μg/L 溶液，按“3.2血樣預(yù)處理”操作，以濃度與峰面積作線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。y=3739.5x+3073.5，R2=0.9996，線線性范圍為50～1000μg/L。

5 方法專屬性

按“3.2血樣預(yù)處理”處理方法和色譜條件，不受血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾，見圖1－2.

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品維生素A經(jīng)“3.2”處理后濃度為400μg/L色譜圖(保留時(shí)間為2.098)

圖2 正常兒童血漿加標(biāo)準(zhǔn)品維生素A經(jīng)“3.2”處理后濃度為500μg/L－1色譜圖(保留時(shí)間為2.098)

6 回收率實(shí)驗(yàn)

標(biāo)本加入0.5～2倍標(biāo)準(zhǔn)品后，按3.2處理，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 回收率統(tǒng)計(jì)表

7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

7.1 儲(chǔ)備液穩(wěn)定性考察，取儲(chǔ)備液分別在1，3，5，7天，配制標(biāo)準(zhǔn)使用液80，400，700μg/L直接進(jìn)樣測(cè)定，峰面積RSD分別為1.1，1.72，2.7%，表明儲(chǔ)備液至少在7天穩(wěn)定。

7.2 樣穩(wěn)定性考察 用正常兒童血漿進(jìn)行精密度試驗(yàn)，由回歸方程計(jì)算實(shí)際濃度，日內(nèi)與日間精密度最大值分別為2.1，5.1%。

8 臨床應(yīng)用 檢測(cè)了300例正常兒童血漿，維生素A濃度于臨床相符，測(cè)定值在300～802μg/L之間。

9 討論

利用維生素A分子中具有共軛多烯醇的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，在325～328nm的范圍內(nèi)有紫外最大吸收，用于含量測(cè)定［7］。樣品處理方法簡(jiǎn)便與快速:經(jīng)液液萃取后經(jīng)氮?dú)庹舭l(fā)，能滿足臨床快速測(cè)定兒童血漿中維生素A含量需求。

［1］李發(fā)美.醫(yī)藥高效液相色譜技術(shù)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1999:243－244.

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［3］侯曉清.HPLC法同時(shí)測(cè)定人中血清維生素A和維生素E［J］.中國藥學(xué)雜志，1997，3(1):28－31.

［4］J.M.Mata－Granados，M.D.Luque de Castro，J.M.Quesada.Fully automated method for the determination of 24，25(OH)2and 25(OH)D3 hydroxyvitamins，and Vitamins A and E in human serum by HPLC［J］.Journal of PharmaceuticaLAnd BiomedicaLAnalysis，2004，35:575 –582.

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［6］國家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國藥典(2010年版二部)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010.

［7］劉文英.藥物分析［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2008:245.