王鈺瑩 羅 清 胡 康 劉 頌 張霓霓 余麗梅*

1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院貴州省細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563003;2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤醫(yī)院，貴州 遵義 563003;3.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，貴州 遵義 563003;4.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦科，貴州 遵義 563003;5.遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院，貴州 遵義 563003

化學(xué)治療是治療惡性腫瘤的三大治療手段之一，由于腫瘤患者存在個(gè)體差異及腫瘤的異質(zhì)性，腫瘤對(duì)各種化療藥物存在著明顯的個(gè)體差異［1，2］，特別是腫瘤復(fù)發(fā)和經(jīng)過(guò)多次化療的患者。因化療前缺乏患者對(duì)化療藥物敏感性和耐藥性的直接檢測(cè)證據(jù)，在制定化療方案時(shí)不可避免地存在著一定的盲目性，選擇藥物不準(zhǔn)確。多數(shù)化療藥物本身的不良反應(yīng)可造成對(duì)機(jī)體的損害，更重要的是可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性，貽誤治療時(shí)機(jī)，增加醫(yī)療成本和患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因而在治療前篩選敏感藥物，選擇高效、有效藥物，進(jìn)行有的放矢的治療早已成為研究者和臨床醫(yī)生關(guān)注的重要問題。

體外抗腫瘤藥物敏感試驗(yàn)的方法及結(jié)果準(zhǔn)確與否是影響病人治療方案制訂的關(guān)鍵因素。本室對(duì)121例開展了ATP－生物熒光體外抗腫瘤藥物敏感性的檢測(cè)，現(xiàn)將檢測(cè)情況總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 腫瘤標(biāo)本 收集2011年9月至2012年12月我院121例腫瘤患者的標(biāo)本進(jìn)行ATP－生物熒光體外抗腫瘤藥物敏感性檢測(cè)。其中乳腺癌89例，卵巢癌16例，子宮內(nèi)膜癌4例，宮頸癌4例，口底鱗癌4例，肺癌3例，非霍奇金淋巴瘤1例。121例患者，年齡在29～76歲。

1.2 化療藥物化療藥物為100%藥物血漿峰值濃度(100%PPC)(見表1)。聯(lián)合用藥的每個(gè)藥物的濃度與單藥濃度相同。

表1 化療藥物及劑量

*因CTX和IFO在體外無(wú)活性，實(shí)驗(yàn)中所采用的是CTX的體內(nèi)活化物苯丁酸氮芥CLB替代。

1.3 儀器和試劑 BHP9504型微孔板發(fā)光分析儀(北京濱松光子技術(shù)股份有限公司)。ATP生物熒光腫瘤藥物敏感性檢測(cè)試劑盒，含混合消化酶、培養(yǎng)基、紅細(xì)胞裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)板(96孔)、ATP提取液和熒光酶－熒光素工作液(北京金紫晶生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)。

1.4 體外藥敏檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

1.4.1 實(shí)體瘤標(biāo)本制備 無(wú)菌取得實(shí)體瘤手術(shù)標(biāo)本，在含抗生素的培養(yǎng)基中浸泡25min后，剪成0.5～1mm3碎塊，置于50 ml離心管中，加用培養(yǎng)基稀釋1倍的混合消化酶10ml，于37℃消化2～4h，用培養(yǎng)基洗滌2次，獲得單細(xì)胞懸液。臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)活的腫瘤細(xì)胞。

1.4.2 漿膜腔積液標(biāo)本的制備 將肝素抗凝的漿膜腔積液標(biāo)本，400g離心10min，去上清，如有大量紅細(xì)胞(＞25%)，加入預(yù)冷的10ml紅細(xì)胞裂解液，冰浴5～10min紅細(xì)胞去除紅細(xì)胞，再加入20ml RPMI 1640培養(yǎng)液，400g離心10分鐘，去上清，加入3～5ml培養(yǎng)基混勻制備得細(xì)胞懸液。臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)活的腫瘤細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度于2～4×106個(gè)/ml備用。

1.4.3 加待測(cè)藥物于96孔培養(yǎng)板，每個(gè)藥物設(shè)100%、50%、25%、12.5%和6.25%PPC 5個(gè)濃度，每個(gè)濃度2個(gè)平行孔，并設(shè)無(wú)藥對(duì)照組(M0)，和最大抑制對(duì)照組(MI)。接種所得腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)為2×104個(gè)/孔。在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)5d后，開始測(cè)定。最大抑制對(duì)照孔加50μl最大抑制劑，其余各孔加50μlATP提取液，在震蕩器上震蕩30s，室溫靜置5min。再次震蕩混勻。每孔取50μl液體，按相應(yīng)的位置加到熒光測(cè)試板內(nèi)，每孔加入50μl熒光素－熒光酶混合液。再次震蕩混勻5s，立刻在微孔板發(fā)光分析儀上測(cè)定熒光強(qiáng)度。

1.5 藥敏檢測(cè)判定標(biāo)準(zhǔn) 計(jì)算藥物IC90和IC50。IC90＜90%且IC50＜25%判定為高度敏感;IC90＜90%或IC50＜25%判定為中度敏感;IC90＞90%且IC50＞25%判定為不敏感。

1.6 吉姆薩染色檢測(cè)漿膜腔積液中脫落細(xì)胞 收集的漿膜腔積液標(biāo)本離心后制備的細(xì)胞懸液，取0.4ml，按常規(guī)方法進(jìn)行制片及染色。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)本的可評(píng)價(jià)率 收集的121例標(biāo)本中，原發(fā)灶手術(shù)標(biāo)本61例，組織穿刺標(biāo)本47例，漿膜腔積液標(biāo)本10例，淋巴結(jié)組織標(biāo)本3例，有117例進(jìn)行了成功的體外藥敏檢測(cè)，可評(píng)價(jià)率為96.69%。4例不成功的標(biāo)本中均來(lái)自乳腺癌患者的穿刺組織，標(biāo)本由空心針進(jìn)行組織穿刺所得，體積較小，獲得的細(xì)胞數(shù)太少而放棄檢測(cè)。

2.2 檢測(cè)方法可行性 實(shí)體瘤手術(shù)后瘤組織標(biāo)本及穿刺活組織標(biāo)本經(jīng)過(guò)消化分離出腫瘤細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種培養(yǎng)5～7天后對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，可見藥物組比M0對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量明顯減少(見圖1)。收集的漿膜腔積液標(biāo)本經(jīng)離心，收集0.5ml細(xì)胞懸液，按脫落細(xì)胞學(xué)方法進(jìn)行常規(guī)吉姆薩染色，可觀察到轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞(見圖2)，說(shuō)明不論實(shí)體瘤組織標(biāo)本還是漿膜腔積液標(biāo)本，用ATP－生物熒光法均能分離得到腫瘤細(xì)胞，且藥物組與M0對(duì)照組比較存活的細(xì)胞明顯減少，由此證明該方法用于體外抗腫瘤藥物敏感試驗(yàn)是可行的。

圖1 體外抗腫瘤藥敏檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)(×200)

圖2 腹水脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)

2.3 藥物敏感性個(gè)體差異性 有效的117例患者選用的均是4～8個(gè)方案，其中有單藥和聯(lián)合用藥，針對(duì)不同的癌標(biāo)本類型，其敏感藥物不同;同一腫瘤類型的患者的標(biāo)本，其敏感藥物也不同。部分患者按常規(guī)方案無(wú)效，但按檢測(cè)結(jié)果選擇敏感方案后癥狀得以明顯緩解(見圖3)，可見腫瘤患者標(biāo)本的藥物敏感性存在個(gè)體差異。

圖3 ATP－生物熒光體外抗腫瘤藥物敏感性檢測(cè)結(jié)果圖示

2.4 與臨床治療效果的吻合度調(diào)查 對(duì)檢測(cè)的117例樣本的病人資料進(jìn)行查閱、追蹤和統(tǒng)計(jì)，因部分病人死亡或僅作一次化療患者資料不能進(jìn)入統(tǒng)計(jì)外，可統(tǒng)計(jì)患者數(shù)量為66例。在該檢測(cè)項(xiàng)目指導(dǎo)下用藥后:乳腺癌，17.5%的患者新輔助化療后腫塊明顯縮小，77.2%的患者狀況平穩(wěn)，5.3%的患者病情出現(xiàn)進(jìn)行性惡化;卵巢癌，50%的患者CA125明顯降低，37.5%的患者狀況平穩(wěn)，12.5%的患者病情出現(xiàn)進(jìn)行性惡化。由以上數(shù)據(jù)可見，該項(xiàng)目在臨床中的陽(yáng)性有效率較高，達(dá)87.5%以上，與臨床醫(yī)生反饋信息吻合度較高。

3 討論

化學(xué)治療是治療惡性腫瘤的常規(guī)有效手段之一。然而，由于腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性存在個(gè)體差異，以及腫瘤細(xì)胞具有多重抗藥性，導(dǎo)致相同藥對(duì)同一類型患者的治療效果不同。如果在用藥前缺乏該癌癥患者對(duì)化療藥物敏感性和耐藥性的直接實(shí)驗(yàn)依據(jù)，在化療方案的制定上就會(huì)存在一定的盲目性，而不敏感藥物的治療及化療藥物對(duì)機(jī)體的損傷及其降低機(jī)體免疫功能等可導(dǎo)致化療失敗，甚至危及生命。

ATP－生物熒光腫瘤體外藥敏檢測(cè)技術(shù)(ATP－tumor chemosensitivity assay，ATP－TCA)是目前較為先進(jìn)的體外藥敏檢測(cè)技術(shù)，其原理是在有氧和ATP的條件下，熒光酶催化熒光素發(fā)出熒光，反應(yīng)中所釋放的熒光強(qiáng)度與ATP含量呈正相關(guān)。ATP是細(xì)胞內(nèi)能量的基本來(lái)源，細(xì)胞死亡后，胞內(nèi)的ATP被迅速水解而活細(xì)胞中ATP含量基本恒定，因此所測(cè)得的熒光強(qiáng)度可以反映活細(xì)胞數(shù)。從而可根據(jù)其判斷抗腫瘤藥物的藥敏結(jié)果。腫瘤細(xì)胞存活率越低，說(shuō)明腫瘤細(xì)胞對(duì)該化療藥物敏感性越高，殺傷力也越強(qiáng)，反之則敏感性越低。

由本室的檢測(cè)結(jié)果可見，該方法能有效地從組織、胸腹水、淋巴結(jié)中分離出腫瘤細(xì)胞并進(jìn)行接種培養(yǎng)，培養(yǎng)一定的時(shí)間后，藥物組較M0無(wú)藥對(duì)照組細(xì)胞數(shù)明顯減少，與藥敏檢測(cè)結(jié)果一致。說(shuō)明用該方法進(jìn)行體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的藥敏檢測(cè)是可行的。細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量的變化與藥物敏感檢測(cè)結(jié)果一致，可見該檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性較高。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外多家研究機(jī)構(gòu)也已應(yīng)用該方法，檢測(cè)了多種惡性腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性，并且已在世界多個(gè)國(guó)家對(duì)該方法進(jìn)行了多中心的臨床研究，證實(shí)其有較高的臨床符合率，抗腫瘤藥物敏感性試驗(yàn)的檢測(cè)及藥物敏感方案的制定在多種腫瘤治療中取得了明顯的效果。德國(guó)科隆大學(xué)醫(yī)學(xué)中心Kurbacher等［1，2］，于 1998 年和 2003 年分別報(bào)道了 ATP －TCA指導(dǎo)化療與傳統(tǒng)化療比較和ATP－TCA輔助化療對(duì)卵巢癌和乳腺癌治療臨床Ⅱ期試驗(yàn)，結(jié)果表明ATP－TCA指導(dǎo)化療能夠顯著提高臨床療效，延長(zhǎng)病人生存期，與傳統(tǒng)化療模式比較差異極為顯著。日本進(jìn)行的臨床研究也表明ATP－TCA指導(dǎo)化療顯著提高了胃腸道腫瘤的治療效果，延長(zhǎng)了病人的生存期［3］。國(guó)外在乳腺癌、肺癌等腫瘤上進(jìn)行的應(yīng)用ATP－TCA法體外藥敏結(jié)果和體內(nèi)有效率的對(duì)比研究表明，體內(nèi)外的結(jié)果比較一致［4－6］。本室所做的檢測(cè)結(jié)果經(jīng)查閱病案后也證實(shí)，其與臨床治療方案的符合率較高，所得到的各種單藥和聯(lián)合用藥的體外藥物敏感性與臨床上觀察的有效率基本一致，部分患者經(jīng)常規(guī)治療失敗后按藥敏方案進(jìn)行治療能有效控制病情。這些結(jié)果均提示，ATP－TCA法可以用于腫瘤的體外藥敏檢測(cè)。

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