李玉蘭

（青海省海北州剛察縣沙柳河鎮(zhèn)獸醫(yī)站，海北 812300）

伴侶動(dòng)物沙門氏菌的分離鑒定及耐藥性試驗(yàn)

李玉蘭

（青海省海北州剛察縣沙柳河鎮(zhèn)獸醫(yī)站，海北 812300）

沙門氏菌是革蘭氏陰性、細(xì)胞內(nèi)寄生的人畜共患的腸道致病菌。迄今為止，世界已發(fā)現(xiàn)2 523個(gè)血清型。其中，我國(guó)發(fā)現(xiàn)的有216種。本菌一年四季均可引發(fā)疾病，一般呈現(xiàn)散發(fā)或地方流行。多種因素可促使本病的發(fā)生，如環(huán)境污染、畜舍擁擠，分娩、手術(shù)和新引進(jìn)家畜未實(shí)行隔離檢疫等都可能造成該病的流行。East Anglia 大學(xué)的研究表明：沙門氏菌感染的發(fā)生不僅存在商店或廚房，而且在飼養(yǎng)場(chǎng)和飼料中也是重要來(lái)源。

目前，依然采取常規(guī)分離鑒定技術(shù)分離沙門氏菌。國(guó)內(nèi)外學(xué)者相繼建立了諸如免疫磁性分離技術(shù)、免疫熒光標(biāo)記、“四管法”檢測(cè)技術(shù)、生物素標(biāo)記DNA 探針、菌落雜交檢測(cè)技術(shù)、核酸檢測(cè)技術(shù)、SPA-協(xié)同凝集試驗(yàn)、PCR 檢測(cè)技術(shù)及常規(guī)ELISA 法和雙抗夾心ELISA法等。自1992年Rahn等首次設(shè)計(jì)出針對(duì)沙門氏菌的特異性引物用于沙門氏菌PCR檢測(cè)以來(lái)，國(guó)內(nèi)外的許多學(xué)者陸續(xù)進(jìn)行了利用PCR技術(shù)檢測(cè)沙門氏菌的研究，并研制成適合臨床應(yīng)用的檢測(cè)試劑盒，通過(guò)對(duì)糞便、水、飼料、畜產(chǎn)品等樣品的沙門氏菌檢測(cè)，為沙門氏菌的檢測(cè)又提供了一種快速、敏感、特異的檢測(cè)方法。這些方法雖然敏感性高和特異性好，但檢測(cè)成本高，易出現(xiàn)假陽(yáng)性，且需要的儀器昂貴，不適宜基層應(yīng)用。本試驗(yàn)選擇國(guó)標(biāo)法GB 47894-2010對(duì)伴侶動(dòng)物源沙門氏菌進(jìn)行分離鑒定及耐藥性試驗(yàn)，現(xiàn)將試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源 隨機(jī)無(wú)菌采取西寧市部分寵物醫(yī)院（和諧、加旺、百斯特）各種犬貓鼻腔分泌物棉簽及直腸深部棉簽，分別剪去末端投入滅菌小試管中并編號(hào)，置4℃冰箱備用。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 SS培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯、普通瓊脂斜面、0.85%生理鹽水、靛基質(zhì)培養(yǎng)基均由青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室制備。葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、鼠李糖、棉子糖、山梨醇、水楊苷、MR、V-P、明膠、硫化氫、西蒙氏枸櫞酸鹽、硝酸鹽、半固體和尿素酶等生化培養(yǎng)基均購(gòu)于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司（批號(hào)：080606）。

1.1.3 分型血清 沙門氏菌屬診斷血清（衛(wèi)生部蘭州生物制品研究院所生產(chǎn)，批號(hào)810003）。

1.1.4 藥敏紙片 氟啶酸（ENX）、呋喃妥因（FT）、頭孢吡肟（FEP）、?？虅冢–EC）、丙氟哌酸（CF）、阿莫西林（AMX）、克林霉素（CM）、強(qiáng)力霉素（DX）、羅美沙星（LMF）、利福平（RA）、磺胺異噁唑（SLZ）、氟羅沙星（FO）、萬(wàn)古霉素（VA）、氯霉素（C）、磷霉素（FOS）、乙基西梭霉素（Netromycin）、復(fù)方新諾明（SXT）、左氧氟沙星（LVF）、美洛西林（MEZ）、奧復(fù)星（OF）、鏈霉素（S300）、青霉素（P）、先鋒霉素VI（CH）、頭孢哌酮（CFP）、卡那霉素（K）、氨卡西林（AMP）、頭孢呋辛（XM）、頭孢噻肟（CTX）、妥布霉素（TM）、羧芐青霉素（AMP）、頭孢美唑（CMZ）、四環(huán)素（TE）、哌拉西林（PIP）、復(fù)達(dá)欣（CAZ）、丁胺卡那霉素（AN）、紅霉素（E）、先鋒霉素V（CFZ）、頭孢曲松（CRO）、慶大霉素（GM10）、阿奇霉素（AZI）40種藥敏紙片購(gòu)于杭州微生物試劑有限公司。

1.1.5 主要試驗(yàn)儀器 游標(biāo)卡尺（0～150 mm，上海量具刃具廠）；微量移液器（上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司）；SHZ-82回旋式氣浴恒溫振蕩器（金壇市科析儀器有限公司）；AB204-E，METTLER TOLEDO電子天平（瑞士產(chǎn)）；琴島-得貝FF40冰箱（中國(guó)青島冰柜廠生產(chǎn)）；YXQ-SG46-280手提式軋電兩用高壓蒸汽滅菌器（丹東市日用五金廠生產(chǎn)）；0704224單筒光學(xué)顯微鏡（中國(guó)重慶奧特光學(xué)儀器有限公司）；KMC-1300V 渦旋混合器（上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠）；HH-B11-600電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津市實(shí)驗(yàn)儀器廠）等。

1.1.6 試驗(yàn)動(dòng)物 健康昆明系小白鼠18只（雌雄不分），12～16 g/只（均購(gòu)于青海省地方病研究所）。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 用微量移液器分別無(wú)菌吸取0.85%滅菌生理鹽水各2 ml依次加入滅菌的小試管中，并相應(yīng)編號(hào)，并在渦旋混合器上震蕩，每支試管震蕩15 min/次，連續(xù)3次。

1.2.2 樣品增菌 分別用微量移液器吸取上述處理好的混懸液1 ml各加入到相應(yīng)的滅菌營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37℃回旋式氣浴恒溫振蕩器培養(yǎng)16～18 h。

1.2.3 目的菌的分離 分別無(wú)菌勾取上述肉湯培養(yǎng)物2～3接劃線種環(huán)于SS培養(yǎng)基平板上，37℃溫箱培養(yǎng)18～24后觀察菌落形態(tài)。

1.2.4 目的菌的純化 挑選SS平板上可疑菌落并進(jìn)行涂片，革蘭氏染色鏡檢，同時(shí)進(jìn)行數(shù)次純化培養(yǎng)，并將純化好的疑似沙門氏菌分別劃線接種于普通瓊脂斜面，37℃溫箱培養(yǎng)18～24 h后置4℃冰箱備用。

1.2.5 生化鑒定 將上述純化好的疑似沙門氏菌菌株分別無(wú)菌接種到葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、鼠李糖、棉子糖、山梨醇、水楊苷、MR、V-P、明膠、硫化氫、西蒙氏枸櫞酸鹽、硝酸鹽、半固體、尿素酶、靛基質(zhì)等生化培養(yǎng)基中，37℃溫箱培養(yǎng)24～48 h，觀察結(jié)果。

1.2.6 血清學(xué)分型 操作方法依據(jù)163種沙門氏菌屬診斷血清使用說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.7 藥敏試驗(yàn) 隨機(jī)選取將上述純化好的2株沙門氏菌菌株分別劃線接種到普通瓊脂斜面上，37℃溫箱培養(yǎng)18～24 h后，再用0.85%滅菌生理鹽水無(wú)菌洗滌，并且用麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷幔x取9×108活菌/ml濃度的菌懸液，用滅菌棉簽蘸取菌液并在管內(nèi)壁上擠去多余的菌液，均勻涂布MH（A）培養(yǎng)基表面（培養(yǎng)基厚度約為4 mm），每次涂布完1/3平板時(shí)將平板旋轉(zhuǎn)60°直至涂滿整個(gè)平板，連續(xù)涂布3次，保證涂均勻。再分別依次貼上上述40種藥敏紙片，每塊平板貼3片，37℃培養(yǎng)18～24 h判定結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）藥敏紙片擴(kuò)散法法規(guī)。

1.2.8 致病性試驗(yàn) 隨機(jī)選取上述進(jìn)行藥敏試驗(yàn)用的1株沙門氏菌菌懸液（9×108活菌/ml）腹腔注射小白鼠1只，0.5ml/只；同時(shí)用0.85%滅菌生理鹽水注射小白鼠1只作對(duì)照，0.5ml/只。

2 結(jié)果

2.1 目的菌的培養(yǎng)特性及菌落形態(tài)觀察

在SS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)呈現(xiàn)出圓形、隆起、邊緣整齊、灰白色的菌落，大部分菌落中心變黑，邊緣灰白色；在麥康凱瓊脂平板上形成圓形、隆起、邊緣整齊、灰白的菌落；在營(yíng)養(yǎng)肉湯中生長(zhǎng)較好，呈現(xiàn)均勻渾濁。經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，鏡下見革蘭氏陰性，無(wú)芽孢的小桿菌。

2.2 生化鑒定

常規(guī)分離培養(yǎng)鑒定技術(shù)檢出樣品中沙門氏菌23株，陽(yáng)性率為18.8%（23/122）。其中Q1是4#、9#、5-1、7#；Q2是8#、3-2、12#、10#、8-2；Q3是3-1、6#、2-2、1#、7-1、4-2；Q4是23-2、11#、5#、2#；Q4是3#、9-2、14-2、6-2。

表1 23株沙門氏菌的生化反應(yīng)結(jié)果

2.3 血清學(xué)分型

通過(guò)血清學(xué)分型共檢出鼠傷寒沙門氏菌7株，占整個(gè)分離株的30.44%（7/23）；丙型副傷寒沙門氏菌4株占整個(gè)分離率的17.40%（4/23）；基爾瓦沙門氏菌Ⅱ2株占整個(gè)分離率的8.70%（2/23）；傷寒沙門氏菌4株，占整個(gè)分離率的17.40%（4/23）；阿邦尼沙門氏菌、徹斯特沙門氏菌和魯齊齊沙門氏菌各1株，占整個(gè)分離率的4.35%（1/23）；甲型沙門氏菌3株，占整個(gè)分離率的13.04%（3/23）。結(jié)果詳見表2。

表2 沙門氏菌血清學(xué)鑒定結(jié)果

2.4 藥敏試驗(yàn)

用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑的大小，測(cè)量3次，即最長(zhǎng)值、最短值、中間值，最后求3次測(cè)量值的平均值。試驗(yàn)結(jié)果見表3、表4。

表3 沙門氏菌耐藥性檢測(cè)結(jié)果

表4 2株沙門氏菌敏感、中介、耐藥數(shù)統(tǒng)計(jì)（單位：種）

2.5 致病性試驗(yàn)

試驗(yàn)組小白鼠于24 h內(nèi)死亡，證明分離菌對(duì)小白鼠有一定的致死作用。對(duì)照組小白鼠飼喂1周后仍健活。無(wú)菌采取肝、脾等臟器觸片，革蘭氏染色，鏡檢見到與上述形態(tài)、染色一致的病原菌，并從死鼠肝、脾中分離出該病原菌，再將這2株分離菌進(jìn)行生化鑒定。結(jié)果顯示，從死亡小鼠體內(nèi)和從樣品中分離的病原菌生化結(jié)果完全一致。

3 討論

3.1 沙門氏菌分離情況

本次分離到沙門氏菌菌株23株，陽(yáng)性率為18.8%（23/122）。經(jīng)血清學(xué)鑒定，23株沙門氏菌中鼠傷寒沙門氏菌占7株；甲型副傷寒沙門氏菌3株；丙型副傷寒沙門氏菌4株；阿邦尼沙門氏菌、徹斯特沙門氏菌和魯齊齊沙門氏菌各1株；傷寒沙門氏菌4株；基爾瓦沙門氏菌Ⅵ2株。由此可見鼠傷寒沙門氏菌為其中的優(yōu)勢(shì)菌株，占整個(gè)分離株的30.44%（7/23）；而阿邦尼沙門氏菌、徹斯特沙門氏菌和魯齊齊沙門氏菌各1株，占整個(gè)分離株的4.35%（1/23）。

3.2 血清型不同，致病情不同，癥狀不同

該菌有兩種適應(yīng)的宿主血清型，對(duì)不同的畜禽其致病性不一樣的。主要感染的動(dòng)物有豬、牛、羊、馬、駱駝、兔、毛皮動(dòng)物及禽等。在各種動(dòng)物上能引起發(fā)病的血清型不同，共同癥狀是食欲下降、下痢，有的還能造成流產(chǎn)等 。

3.3 人獸共患

近幾年來(lái)，醫(yī)院內(nèi)嬰幼兒和動(dòng)物感染沙門氏菌都十分嚴(yán)重，并有逐步成上升的趨勢(shì)，沙門氏菌一旦感染人就會(huì)造成人的胃腸炎急病和食物中毒。臨床表現(xiàn)主要是惡心、嘔吐、腹瀉、頭暈、發(fā)燒、四肢無(wú)力等癥狀。人感染沙門氏菌主要是與食用了被沙門氏菌污染的食物有關(guān)。

3.4 抗生素治療

耐藥性問(wèn)題已成為全世界關(guān)注的焦點(diǎn)，由于濫用抗生素，沙門氏菌的抗菌譜越來(lái)越廣，強(qiáng)度也越來(lái)越大。為此，我們從分離的23株沙門氏菌中隨機(jī)選取了2株沙門氏菌分離株進(jìn)行了耐藥性監(jiān)測(cè)。結(jié)果顯示，4#菌株對(duì)于VA、FT、SXT、E、TE、CM、P、AZI、S300和FO等15種藥物有耐藥性，耐藥率37.5%（15/40）；23-2#菌株對(duì)于FT、VA、E、TE、C、S300、FO和AZI等13種藥物有耐藥性，耐藥率為32.5%（13/40）。

3.5 預(yù)防

由于伴侶動(dòng)物與人接觸密切，尤其是少年兒童對(duì)于伴侶動(dòng)物尤為偏愛。所以對(duì)于經(jīng)常接觸寵物且沒(méi)防范措施的兒童來(lái)說(shuō)，極易感染沙門氏菌。在本次藥敏監(jiān)測(cè)中，4#菌株對(duì)TM、PIP、AMP、FEP、LVF、FOS、MEZ、XM、CFZ、ENX和AMP等20種藥物敏感，敏感率50.00%（20/40）；對(duì)CAZ、Netromycin、CEC、AMX和CF等5種藥物中介，中介率12.5%（5/40）。23-2#菌株對(duì)SXT、PIP、AMP、FEP、CAZ、CAZ、CRO、MEZ、SLZ、XM、CFZ和AMP等20種藥物敏感，敏感率50.00%（20/40）；對(duì)TM、LVF、Netromycin、FO、AMX、CF和ENX等7種藥物中介，中介率17.5%（7/40）。其中，頭孢類的藥物尤為顯著，因此，一旦沙門氏菌在伴侶動(dòng)物之間傳播或與人交叉感染時(shí)，應(yīng)進(jìn)行藥物的篩選，選取2～3種敏感或中介藥物進(jìn)行交替治療，避免耐藥菌株的產(chǎn)生。

3.6 分離率

本次分離到沙門氏菌菌株23株，陽(yáng)性率為18.8%（23/122）。與在本實(shí)驗(yàn)室中所做的其他樣品（動(dòng)物性飼料、香腸、火腿腸、豬胴體、牛羊胴體、鯽魚鰓、仔蝦、雞蛋）中沙門氏菌帶菌情況進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離率有著明顯的不同。此次的分離率比以前的要明顯偏低。分析原因，可能與樣品的不同有關(guān)。

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