莊立峰，林春榕，潘 云，魯智英，周 雨，黃 勇，姚 瑤，吳學(xué)東

（大理學(xué)院：1.附屬醫(yī)院暨臨床醫(yī)學(xué)研究中心；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，云南 大理 671000）

腸缺血－再灌注（Ischemia－reperfusion，I／R）及其所導(dǎo)致的腸管損傷是常見的臨床問題，由于通常情況下難以獲得人體腸組織標(biāo)本進(jìn)行研究，僅偶見人腸組織學(xué)研究報(bào)道，所以，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究報(bào)道較多［1］。腸I／R 也是小兒常見的問題［2－3］，也不乏因腸壞死需行腸切除者，將不同程度地影響小兒病情的康復(fù)和生長(zhǎng)發(fā)育。然而，在現(xiàn)有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代研究中，對(duì)幼仔腸I／R所致腸管損傷的研究報(bào)道較少，因而對(duì)小兒腸I／R損傷的認(rèn)識(shí)有待深入研究。本研究利用幼鼠造成腸I／R損傷模型并動(dòng)態(tài)觀察腸管的I／R損傷及利多卡因?qū)δc管再灌注損傷的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇4周齡SPF級(jí)的健康SD幼鼠48只，雌雄不限。

1.2 儀器與試劑 10%水合氯醛溶液5mL（大理學(xué)院附屬醫(yī)院制劑室配制）；鹽酸利多卡因注射液（上海朝暉藥業(yè)有限公司）；0.9%生理鹽水，常用消毒劑，小手術(shù)器械及手術(shù)用品，BM－Ⅷ生物組織包埋及冷凍機(jī)（孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司），PHY－Ⅲ病理組織漂烘儀（常州市中威電子儀器有限公司），萊卡石蠟切片機(jī)（LEICARM 2025型），OLYMPUS BX－41型多功能生物顯微鏡（日本奧林巴斯光學(xué)有限公司）和HMIAS－2000型高清晰醫(yī)學(xué)彩色圖像分析儀（武漢千屏影像公司）等。

1.3 方法 動(dòng)物編號(hào)：許可證SCXK（渝）2007－017，體質(zhì)量（100±15）g。手術(shù)室溫度25～27℃，相對(duì)濕度50%～65%。用10%水合氯醛溶液腹腔內(nèi)注射（3mL／kg）麻醉后仰臥位固定，腹部去毛，消毒后取上腹正中縱向切口，依次切開入腹，尋找并游離腸系膜上動(dòng)脈（superior mesenteric artery，SMA）根部，用橡皮條阻斷腸系膜上動(dòng)脈血流1h，松開橡皮條，恢復(fù)腸系膜血流，造成小腸I／R模型。

隨機(jī)分為假手術(shù)組、I／R組和利多卡因干預(yù)組，每組16只。假手術(shù)組僅暴露腹腔臟器，不作任何干預(yù)；I／R組于再灌注前經(jīng)股靜脈注射生理鹽水0.5mL，而利多卡因干預(yù)組經(jīng)相同途徑注射利多卡因2mg／kg（稀釋在0.5mL的生理鹽水中）；于再灌注后30、60、90、120min 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組各處死動(dòng)物4只，取距回盲瓣5cm處近端2cm長(zhǎng)的小腸作為標(biāo)本，備做組織學(xué)研究。

1.4 組織學(xué)觀察 將所取小腸組織制成6～8μm厚度的切片后進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腸黏膜的形態(tài)學(xué)變化，每張切片隨機(jī)選擇鏡下10個(gè)視野（×100），腸黏膜損傷程度按Chiu氏6級(jí)評(píng)分法［4－5］進(jìn)行組織病理評(píng)分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析和配對(duì)t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 組織學(xué)觀察 假手術(shù)組小腸組織形態(tài)正常，無水腫及出血（圖1A）；缺血1h時(shí)腸壁和絨毛結(jié)構(gòu)完整，但腸壁炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，可見點(diǎn)狀出血和絨毛倒伏，黏膜面無明顯滲出（圖1B）。

I／R組和利多卡因干預(yù)組在再灌注各時(shí)間點(diǎn)腸組織病理變化明顯，主要表現(xiàn)為小腸絨毛脫落和缺損、點(diǎn)狀出血和潰瘍形成、黏膜不同程度的絨毛排列紊亂和組織內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2A），直到再灌注120min時(shí)腸組織形態(tài)無明顯改善，但壞死和出血情況也無明顯加重（圖2B）。在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)中，病理改變以90min時(shí)最為明顯，而相比之下，各時(shí)間點(diǎn)的病理改變程度利多卡因干預(yù)組較I／R組稍輕（圖2C～D）。

圖1 正常腸組織和假手術(shù)組缺血1h腸組織（HE，×100）

圖2 I／R組和利多卡因干預(yù)組I／R后腸組織（光學(xué)顯微鏡，×100）

圖3 3組幼鼠再灌注30、60、90、120min腸黏膜病理Chiu氏評(píng)分趨勢(shì)圖

2.2 腸黏膜損傷程度的Chiu氏6級(jí)評(píng)分 通過對(duì)小腸組織進(jìn)行病理損傷的Chiu氏6級(jí)評(píng)分法評(píng)估，記錄獲得各組各時(shí)間點(diǎn)的平均分值如表1，3組各時(shí)間點(diǎn)Chiu氏評(píng)分以I／R組得分最高。各組各時(shí)間點(diǎn)的Chiu氏評(píng)分變化趨勢(shì)見圖3。I／R組和利多卡因干預(yù)組均從30min開始呈現(xiàn)評(píng)分逐漸增高的趨勢(shì)，到90min達(dá)到峰值，在120min時(shí)呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，而此時(shí)利多卡因干預(yù)組的評(píng)分與再灌注30min時(shí)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 3組各時(shí)間點(diǎn)小腸黏膜損傷病理Chiu氏評(píng)分比較

表1 3組各時(shí)間點(diǎn)小腸黏膜損傷病理Chiu氏評(píng)分比較

組別 n 16 0.26±0.40 0.25±0.47 0.17±0.55 0.39±0.50 I／R組 16 3.00±0.89 4.02±0.69 4.87±0.73 4.01±0.64利多卡因干預(yù)組30min 60min 90min 120min假手術(shù)組16 2.00±0.78 3.01±0.49 3.06±0.53 1.94±0.43

3 討 論

腸I／R在小兒腹部外科是一常見情況，除由于腸壞死作腸切除外，不論先天還是后天獲得性原因?qū)е赂鞣N類型絞窄性腸梗阻如腸套疊、腸扭轉(zhuǎn)、腸管絞窄性疝等的松解或整復(fù)術(shù)后、各種原因?qū)е碌脱萘啃菘藬U(kuò)容后、小腸移植術(shù)后等都發(fā)生了腸I／R，血流再灌注后，被灌注組織原有的病理損傷將進(jìn)一步加重，從而形成腸I／R損傷。臨床實(shí)踐中，在各種類型絞窄性腸梗阻整復(fù)后，通常以普魯卡因進(jìn)行腸系膜封閉結(jié)合腸管的濕熱敷以促進(jìn)腸系膜和腸管的血流恢復(fù)，然而對(duì)由于再灌注引起的腸組織變化認(rèn)識(shí)并不多，本研究通過手術(shù)先阻斷后恢復(fù)幼鼠腸系膜上動(dòng)脈血供，成功獲得幼鼠小腸I／R模型［6］，在此基礎(chǔ)上，通過利多卡因干預(yù)動(dòng)態(tài)觀察其對(duì)腸管再灌注損傷的影響。

由于腸道特殊的解剖部位和生理特點(diǎn)，腸黏膜對(duì)缺血、缺氧十分敏感，也是再灌注損傷時(shí)最易受累的器官之一。通過對(duì)再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)小腸組織的觀察，腸組織的病理變化在觀察時(shí)間內(nèi)主要突出了絨毛的改變，出現(xiàn)了絨毛排列紊亂和局部脫落、黏膜點(diǎn)狀出血和潰瘍形成及組織內(nèi)有程度不等的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等，而腸壁黏膜下層、肌層和漿膜層仍保持完好，未發(fā)生腸壁局灶壞死穿孔，腸組織的這些病理改變呈現(xiàn)隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸加重的趨勢(shì)，但以再灌注90min時(shí)的變化最為明顯，120min時(shí)略有減輕。通過腸組織病理損傷的Chiu氏6級(jí)評(píng)分獲得了同樣的結(jié)果，這是否提示在無任何干預(yù)的情況下腸I／R損傷將在再灌注后短時(shí)間內(nèi)即逐漸修復(fù)，尚難以得出結(jié)論。

發(fā)生I／R后，除了腸道本身發(fā)生以炎癥反應(yīng)為主的再灌注損傷，更為重要的是，由于腸道黏膜屏障功能破壞，導(dǎo)致腸道內(nèi)細(xì)菌移位和內(nèi)毒素釋放入血，促發(fā)多種細(xì)胞因子和組織因子的釋放，加重局部的損傷甚至導(dǎo)致遠(yuǎn)膈器官的損害，從而可能導(dǎo)致嚴(yán)重后果［7－10］。然而，臨床研究結(jié)果表明，盡管腸I／R在小兒是常見的，但并非都將發(fā)生嚴(yán)重情況，絕大多數(shù)患兒在去除導(dǎo)致腸缺血的原因后雖有短暫的程度不等的內(nèi)毒素血癥期，但均能順利恢復(fù)，這可能提示，在缺血的腸管恢復(fù)血流灌注后發(fā)生的再灌注損傷將隨著時(shí)間的推移或在相應(yīng)治療藥物的干預(yù)下逐漸得到修復(fù)，而本研究幼鼠腸組織病理損傷在120min觀察期內(nèi)出現(xiàn)了從加重到減輕的轉(zhuǎn)變，也從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)角度驗(yàn)證了小兒腸道I／R損傷的臨床過程。

有研究認(rèn)為，利多卡因除了作為經(jīng)典的局部麻醉藥和抗心律失常藥外，還是一種非特異性的膜穩(wěn)定劑。同時(shí)，利多卡因還能通過抑制中性粒細(xì)胞游走、超氧陰離子和炎癥介質(zhì)的釋放及黏附分子的表達(dá)等而發(fā)揮抗炎作用［11－12］。根據(jù)利多卡因的這一作用機(jī)制，利用利多卡因?qū)π∧cI／R幼鼠進(jìn)行干預(yù)，盡管腸管也發(fā)生了I／R損傷，而且發(fā)生變化的趨勢(shì)也與非干預(yù)組的變化基本一致，但不論腸組織形態(tài)還是再灌注所致病理損傷的Chiu氏6級(jí)評(píng)分都顯示了腸管在再灌注后各時(shí)間點(diǎn)的病理改變均較非干預(yù)組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相對(duì)減輕，表明利多卡因能在一定程度上減輕腸管的再灌注損傷。可能的機(jī)制是，利多卡因通過增強(qiáng)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性而發(fā)揮對(duì)腸組織再灌注損傷的保護(hù)作用，并通過抑制中性粒細(xì)胞的功能而減輕組織的炎癥反應(yīng)，從而使在再灌注后的各時(shí)間點(diǎn)腸組織的病理損傷程度比非利多卡因干預(yù)組相對(duì)較輕。

本研究結(jié)果表明，不論是I／R組還是利多卡因干預(yù)組，觀察期內(nèi)腸組織病理損傷程度均發(fā)生了從加重到減輕的轉(zhuǎn)折性變化。這一方面可能說明觀察的時(shí)間尚不夠長(zhǎng)，所得數(shù)據(jù)僅能反映觀察期內(nèi)某個(gè)時(shí)間點(diǎn)的病理改變，但有研究對(duì)成年鼠I／R損傷的實(shí)驗(yàn)觀察8～24h，各種處理因素獲得的病理評(píng)分并無較大的波動(dòng)［13－14］；另一方面，本研究觀察的結(jié)果可能與幼鼠鼠齡小和處理因素有關(guān)，幼年動(dòng)物（包括人）由于組織中水的含量大于成年動(dòng)物，同時(shí)機(jī)體的防御機(jī)制發(fā)育并不完善，因而一旦有損傷因素存在，組織將發(fā)生快速而明顯的反應(yīng)，也由于幼年動(dòng)物的修復(fù)能力較強(qiáng)，一旦損傷因素去除，修復(fù)也比較快。也有研究表明，幼年動(dòng)物的病理改變較成年動(dòng)物的改變輕［13］，但也有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，利多卡因具有保護(hù)缺血－再灌注腸道平滑肌的作用［15］，這些研究的結(jié)果在一定程度上支持了本研究幼鼠腸組織的病理改變。

因此，本研究表明，小腸I／R幼鼠腸組織發(fā)生了明顯的炎癥反應(yīng)，小腸絨毛發(fā)生了明顯的病理改變，而通過利多卡因干預(yù)，在一定程度上減輕了腸I／R所致的腸組織病理損傷。

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