田嘉瑩,盛寶英,齊志國(guó)

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,黑龍江 佳木斯 154003)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病以老年人進(jìn)行性癡呆加重為其主要特征,特點(diǎn)為逐漸出現(xiàn)腦認(rèn)知功能障礙、記憶能力減退、行為異常、社交困難,神經(jīng)心理癥及精神行為異常等的表現(xiàn)[1～2]。AD發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜,主要病理特征是老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)的沉積,伴腦皮質(zhì)層神經(jīng)元減少[3],老年斑的主要成分是β-淀粉樣多肽(A β),其聚集被認(rèn)為是 AD致病的核心因素。本實(shí)驗(yàn)以 A βl-40與神經(jīng)干細(xì)胞共孵育,MT T法檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞的存活率、比色法檢測(cè) Caspase-3的活性變化,探討 A βl-40對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞致傷的作用,進(jìn)一步探討 AD的發(fā)病機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、儀器及主要試劑

雄性 Wistar大鼠(＜24h),由佳木斯大學(xué)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)共分兩組,A β1-40處理組:在傳代培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞加入 A β1-405 μm,②對(duì)照組:不加 A β1-405 μm余同 A β1-40處理組。分別孵育0h,12h,24h和48h。酶標(biāo)計(jì)數(shù)儀 ELX800(Bio-TEK公司 );二氧化碳培養(yǎng)箱 (美國(guó) Nurare公司 );DMEM/F12(Gibco);四甲基偶氮唑藍(lán) (M TT)、多聚賴氨酸(美國(guó)Sigma);A β1-40(Biosouxee公司 );Caspase分析試劑盒 (美國(guó)Promega公司);二氧化碳培養(yǎng)箱 (美國(guó) Nurare公司);Nestin(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的分離、傳代培養(yǎng)及鑒定[4～7]

取出新生 Wistar大鼠(＜24h),無(wú)菌操作下打開(kāi)顱腔,分離鉗取海馬區(qū)組織,用 Hank,s液漂洗 3次 ,并且移至預(yù)先加入適量 DM EM/F12培養(yǎng)液的容器中,將海馬組織塊剪成1mm3左右的小塊,輕輕吹打制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度,接種于培養(yǎng)基中,放入培養(yǎng)箱,隔 2～3d換半量培養(yǎng)液一次,每7天傳代一次。將培養(yǎng) 2-3代的神經(jīng)球滴在涂布0.1%多聚賴氨酸的無(wú)菌蓋玻片上,37℃,5%CO2培養(yǎng)箱孵育2h后,用0.01MPBS洗滌,冷風(fēng)吹干后,行 Nestin細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)鑒定神經(jīng)干細(xì)胞。

1.2.2 MT T還原法檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞的存活率

兩組傳代培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)不同處理后,培養(yǎng)不同的時(shí)間在37℃培養(yǎng)箱內(nèi),終止培養(yǎng)前4h每孔加入四甲基偶氮唑藍(lán) (M TT)溶液 (5mg/mL)20μL至終濃度為 1mg/mL,置37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h,采用翻板法將96孔板內(nèi)的培養(yǎng)基棄去,終止培養(yǎng),小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。然后在每孔中加入溶解液二甲基亞砜 (DM SO)150μL,低速振蕩 10min使結(jié)晶產(chǎn)物充分溶解。在酶標(biāo)儀上以波長(zhǎng)570nm檢測(cè)每孔的 OD值。所檢測(cè) OD值的大小可反映神經(jīng)干細(xì)胞代謝活性的強(qiáng)弱。每組設(shè)3個(gè)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次 ,神經(jīng)干細(xì)胞存活率的計(jì)算:細(xì)胞存活率=試驗(yàn)組光吸收值 /對(duì)照組光吸收值×100%。

1.2.3 比色法檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞 Caspase-3的活性變化

將不同處理組細(xì)胞,用冰冷的 PBS在細(xì)胞表面洗兩次,然后用細(xì)胞刮收集到 EPPendoff管內(nèi),4℃下450×g離心10min后收集細(xì)胞,然后放于冰上。用冰冷的 PBS洗一次,然后將其懸浮在100uL細(xì)胞裂解緩沖液(試劑盒提供 )中。以凍融循環(huán)(液氮-常溫)的方式裂解細(xì)胞,然后在冰上孵育15min,4℃下 15,000× g離心 20min,然后收集上清液。用Bradford方法檢測(cè)蛋白的濃度。按試劑盒依次在96孔板內(nèi)依次 加樣。加 2 μL DEVD-pN A底物 (10mm)到96孔板內(nèi)。用parafilm封口膜將板子封嚴(yán),37℃孵育4h。在405nm測(cè)量吸光度。計(jì)算 Caspase-3特異性活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 17.0軟件,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (±s)表示,采用 t檢驗(yàn),多組間均數(shù)比較通過(guò)方差齊性檢驗(yàn)后用方差分析,各組間兩兩比較用 q檢驗(yàn),P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 A β1-40不同培養(yǎng)時(shí)間各組神經(jīng)干細(xì)胞存活率的變化

應(yīng)用 M TT法對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞存活率進(jìn)行觀察,結(jié)果表明: A β1-40呈時(shí)間依賴性地降低神經(jīng)干細(xì)胞的存活率。加入A β1-40后0h,12h,24h和48h,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),神經(jīng)干細(xì)胞存活率逐漸降低,(P ＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同培養(yǎng)時(shí)間各組神經(jīng)干細(xì)胞存活率的變化(%,±s)

表1 不同培養(yǎng)時(shí)間各組神經(jīng)干細(xì)胞存活率的變化(%,±s)

注:a不同時(shí)間 Aβ1-40處理組與對(duì)照組相比,P ＜ 0.05;b24hAβ1-40處理組與 12hAβ1-40處理組相比,P ＜ 0.05;c48hAβ1-40處理組與24hA β 1-40處理組相比 ,P ＜ 0.05。

組別 0h(%) 12h(%) 24h(%) 48h(%)A β1-40處理組 98.67± 3.77 89.7± 3.2 69.3± 2.7a,b 62.7± 7.3a,c對(duì)照組 99.85± 3.33 99.95± 4.26 99.05± 5.10 99.79± 5.26

2.2 A β1-40孵育不同時(shí)間后神經(jīng)干細(xì)胞 Caspase-3的活性變化

A β1-40處理組分別孵育 0h,12h,24h和48h后,致傷的神經(jīng)干細(xì)胞 Caspase-3活性逐漸增加,在 24h達(dá)到高峰(P＜0.05),而空白組孵育0h,12h,24h和48h后神經(jīng)干細(xì)胞 Caspase-3特異性活性未發(fā)生明顯改變。A β1-40處理組與空白對(duì)照組相比較有顯著性 (P＜0.05)見(jiàn)表 2。

表2 A β1-40不同孵育時(shí)間各組神經(jīng)干細(xì)胞 Caspase-3的活性變化 (pmol/h˙μg,±s)

表2 A β1-40不同孵育時(shí)間各組神經(jīng)干細(xì)胞 Caspase-3的活性變化 (pmol/h˙μg,±s)

注:a不同時(shí)間 Aβ1-40處理組與對(duì)照組相比,P ＜ 0.05;b24hAβ1-40處理組與 12hAβ1-40處理組相比,P ＜ 0.05;c48hAβ1-40處理組與24hA β 1-40處理組相比 ,P ＜ 0.05。

組別 0h 12h 24h 48h A β1-40處理組 5.79± 0.48 8.34± 1.85a 12.46± 0.47a,b 9.73± 0.34a,c對(duì)照組 5.34± 0.42 5.45± 0.63 5.12± 0.58 5.68± 0.66

3 討論

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是神經(jīng)系統(tǒng)退行性變性疾病之一。AD的病理特征為β-淀粉樣肽聚集成的淀粉樣斑塊、腦神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)異常磷酸化的 tau蛋白異常沉積構(gòu)成的神經(jīng)纖維病變,并伴有腦皮層神經(jīng)細(xì)胞減少的血管淀粉樣變性。淀粉樣蛋白聚集與 A β的前體蛋白過(guò)量表達(dá)或基因突變密切相關(guān)。APP具有β樣折疊構(gòu)型,A β1-42約占10%左右,A β1-40約占 90%。本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),A β1-40使神經(jīng)干細(xì)胞的存活率隨著時(shí)間的推移明顯的下降。A β1-40孵育的神經(jīng)干細(xì)胞0h,12h,24h和48h后 ,與空白對(duì)照組比較 ,致傷后神經(jīng)干細(xì)胞的 Caspase-3的活性是逐漸增加的,24h達(dá)到高峰,而48h后有所下降,但仍高于空白對(duì)照組。表明神經(jīng)干細(xì)胞在接受 A β1-40毒性致傷后 ,Caspase-3的活性隨時(shí)間增加而遞增,但并不是始終保持高水平激活狀態(tài),而是高峰后逐漸保持低水平,保持低活性狀態(tài)發(fā)揮其促凋亡作用。表明A β1-40對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞有致傷作用可能通過(guò)凋亡途徑導(dǎo)致細(xì)胞死亡的。由于 A β1-40對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的毒性造成了神經(jīng)干細(xì)胞不能及時(shí)補(bǔ)充 AD患者大腦缺失的神經(jīng)元可能是 AD發(fā)病的原因之一[8]。提示研究 A β1-40致傷的神經(jīng)干細(xì)胞死亡的機(jī)制可能為 AD的治療提供潛在的分子靶點(diǎn)。

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