國玉芝,孟婷婷,黃 展,雷力力

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003)

洋托拉唑(pantoprazole,PAN),是奧美拉唑、蘭索拉唑上市后的第三代質(zhì)子泵抑制劑(proton pump inhibitors,PPIs),臨床上廣泛用于治療各種酸相關(guān)性疾病,如消化性潰瘍,胃食管反流性疾病等。其主要由 P450 CYP2C19代謝,由于編碼該酶的基因突變,使人群分為強(qiáng)代謝(extensive metabolizers,EM)、中代謝 (intermediate metabolizers,IM)與弱代謝(poor metabolizer,PM)三種基因型,藥物的藥理作用在不同基因型之間的藥理作用不同[1～3],即不同基因型患者服用相同劑量的藥物會產(chǎn)生不同的治療效果,所以不同基因型的患者應(yīng)該差別用藥,以達(dá)到經(jīng)濟(jì)有效的目的。但是,國內(nèi)對于人群中不同 CYP2C19基因型對于泮托拉唑代謝的影響研究報道較少,尤其是不同地區(qū)及生活習(xí)性的不同可能基因型分布也會有一些差異,黑龍江地處高寒地區(qū),人群使用腌菜及食鹽較多,基因型分布及對泮托拉唑代謝的影響會否不同,尚未見報道,由于在 CYP2C19基因變異種 CYP2C19*2位點(diǎn)變異較多,研究意義較大,因而我們對其基因型分布及對泮托拉唑藥動學(xué)的影響進(jìn)行研究,以為提高用藥的針對性,提高藥物療效,減少不良反應(yīng),保證用藥安全提供基礎(chǔ)資料。

1 儀器及試劑

大連依利特 P230Ⅱ高效液相色譜儀,Waters2475多波長熒光檢測器,EC2006色譜數(shù)據(jù)處理工作站。BIO-RAD S1000Thermal CyclerPCR儀,BIO- RAD PowerPac Universal通用電泳儀,BIO-RAD ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng),安徽中科中佳 HC-2518R高速離心機(jī)。

色譜純乙腈:天津凱通化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);泮托拉唑、蘭索拉唑購自中國藥品生物制品檢定所。Genomic DN A Purification kit,Star pcr Taq,50bp DNA Marker,HphⅠ ,以上試劑為 Fermentas公司生產(chǎn)。CYP2C19* 2擴(kuò)增引物由生工生物工程(上海)有限公司合成,DN A測序由生工生物工程(上海)有限公司北京測序部完成。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計及受試者選擇

2.1.1 受試者選擇:在健康體檢人員中隨機(jī)選擇100名經(jīng)心電圖、胸透、血尿常規(guī)、肝腎功能均正常人員入選進(jìn)行CYP2C19*2基因檢測,從中挑選快(AA基因型)、中(GA基因型)、慢(GG基因型)代謝人員各8名進(jìn)行藥動學(xué)實(shí)驗(yàn) ,試驗(yàn)前遵循赫爾辛基宣言,經(jīng)醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn),受試者在被告知所有可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)后,簽署知情同意書。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)方案:健康志愿者從試驗(yàn)前2周開始及試驗(yàn)期間不得服任何藥物,禁用含酒精、咖啡因飲料。于服藥前日晚8:00起禁食,于次日晨 8:00口服泮托拉唑腸溶膠囊40mg,溫開水 200mL送服。服藥后4h統(tǒng)一進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)餐。受試者在給藥前及給藥后1,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5,6,7,9,12h各抽取肘靜脈血4.0mL。血樣經(jīng)檸檬酸鈉抗凝,靜置10min后,3500rpm離心10min,收集上層血漿,-20℃保存待測。所有樣品在取樣后10d內(nèi)測定完畢。

2.2 基因檢測

PCR引物:上游引物 5’一 CAG AGC T TG GCA TAT TGT ATC-3',下游引物 5’一 GTA AAC ACA CAA CTA GTC AAT G-3'。PCR:Hot Star酶12.5μL,F、R引物各1μL,提取 DN A2 μL,ddH2O 9.5 μL。95℃預(yù)變性 4min,95℃變性 30s,56℃退火 30s,72℃延伸 30s,72℃末延伸 5min,35個循環(huán)。酶切及電泳:10×green buffer2μL,PCR產(chǎn)物 15μL,SmaⅠ 2μL,ddH2O10μL;水浴 37℃酶切 5min,然后取出置水浴65℃滅火 5min。使用 2.0%瓊脂糖凝膠,電壓 145V,電泳40min。

2.3 血藥濃度檢測方法

血漿中泮托拉唑采用高效液相色譜法測定,取血漿0.5mL,加內(nèi)標(biāo)蘭索拉唑 (含蘭索拉唑 0.0332mg˙mL-1)25μL,0.1molμL-1氫氧化鈉溶液 50μL,漩渦混勻 ,加無水乙醚-乙酸乙酯混合液 (3:2)3mL,漩渦提取,3000r˙min-1離心5min,分取有機(jī)層,38℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈?殘?jiān)蛹状?.1mL漩 渦溶解 ,3000r˙min-1離心 5min,進(jìn)樣 40 μL。色譜柱:Hpersil ODS2C18(4.6mm× 150mm,5μm);流 動 相:0.01mol μL-1磷酸氫二鉀溶液 (磷酸調(diào) pH7.0)-乙腈 (72:28);流速:1.4mL˙min-1;檢測波長:288nm;柱溫:35℃。以泮托拉唑樣品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(X)對其加入濃度(Y)作線性回歸,得回歸方程為:y=0.7897x+ 0.0939,R2=0.9978,線性范圍為:0.019μ g˙mL-1～12.672μ g˙mL-1,定量下限為:0.019 μg˙mL-1。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

PAN的藥時曲線用3P97程序作參數(shù)估算。Cmax和 Tmax用實(shí)測值。采用梯形法計算曲線下面積(AUC),計量資料兩組比較時采用 t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 基因型分析

PCR產(chǎn)物為321bp,681位堿基為 G時 ,PCR產(chǎn)物能被Sma I酶切 ,酶切后產(chǎn)生212bp,109bp2個片段,681位堿基為A則不能被 Sma I酶切 ,只有 1個 321bp的片段。因此可區(qū)分為三種不同的基因型:GG型酶切后產(chǎn)生212bp,109bp 2個片段,GA型酶切后產(chǎn)生321bp,212bp,109bp三個片段,AA型不能被酶切,只有321bp一個片段。

在本試驗(yàn)條件下,三種不同基因型能夠清晰分離,見圖1;經(jīng)毛細(xì)管電泳測序,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,見圖 2。

圖1 CYP2C19*2電泳圖譜

圖2 CYP2C19*2測序圖譜

3.2 泮托拉唑藥動學(xué)

在本實(shí)驗(yàn)條件下,泮托拉唑與內(nèi)標(biāo)蘭索拉唑分離良好,血漿內(nèi)源性成分不影響檢測 ,泮托拉唑低中高0.095、0.792、6.336 μg˙mL-1三種濃度準(zhǔn)確度在 99.00% ～102.00%,日內(nèi)及日間 RSD在 3.00%～14.00%,血漿樣品-20℃保存20d內(nèi)穩(wěn)定。

按基因型分組口服40mg泮托拉唑后的藥-時曲線見圖3,經(jīng)3P97軟件處理后,各項(xiàng)數(shù)據(jù)如表1。

圖3 口服泮托拉唑后的藥-時曲線

表1 三種基因型單劑量口服泮托拉唑后主要藥動學(xué)參數(shù) (±s,n=8)

表1 三種基因型單劑量口服泮托拉唑后主要藥動學(xué)參數(shù) (±s,n=8)

GG與 GA型、△GA與 AA之間有顯著性 P＜0.05;# GG與 AA之間有高度顯著性 P＜0.01。

基因型 Ke/h-1 Ka/h-1 t1/2/h Tmax/h Cmax/mg˙L-1 AUC/mg˙h-1 CL/F/L˙h-1 Vd/F/L GG 0.34± 0.06*# 0.82± 0.75 2.11± 0.32*# 2.92± 0.53 2.2± 0.49*# 7.15± 2.27*# 6.21± 2.28*# 18.84± 7.39*#GA 0.45± 0.08 0.89± 0.15 1.59± 0.39△ 3.12± 0.23 3.41± 0.65△ 12.63± 4.24△ 3.46± 1.03△ 7.55± 1.29 AA 0.19± 0.06 0.68± 0.33 3.73± 0.99 3.56± 0.62 4.67± 1.13 33.43± 14.13 1.41± 0.61 6.92± 1.64*

三組泮托拉唑受試者口服后的藥時曲線經(jīng)3P97軟件分析,符合一房室模型,由表 1可見,藥動學(xué)參數(shù) t1/2、Cmax、AUC、CL/F在三組之間,Ke、Vd/F在 GG與 GA、AA之間,Tmax在 GG型與 AA型二組之間差異有顯著性 (P ＜0.05)。藥動學(xué)參數(shù) Ke、 t1/2、 Cmax、 AUC、CL/F、Vd/F在 GG與 AA基因型之間有高度顯著性 (P＜0.01)。

4 討論

藥物反應(yīng)個體間差異廣泛存在,藥物代謝酶基因、轉(zhuǎn)運(yùn)體基因、受體基因、靶體基因以及表觀遺傳的多態(tài)性與藥物代謝、藥物效應(yīng)及毒性的個體間差異密切相關(guān)[4]。個體化給藥要求綜合考慮個體的基因與環(huán)境因素,全面預(yù)測個體患病風(fēng)險以及對藥物的反應(yīng)效果,選擇最佳處方,優(yōu)化疾病治療[5]。根據(jù)不同個體的基因多態(tài)性來選擇藥物和給藥方案,將為個體化合理用藥提供強(qiáng)有力的科學(xué)依據(jù)。

本試驗(yàn)研究泮托拉唑藥動學(xué)與 CYP2C19*2基因型的關(guān)系。所有受試者按方案完成全部試驗(yàn),未有中途退出,未出現(xiàn)任何不良反應(yīng)。

由試驗(yàn)結(jié)果看出,不同 CYP2C19*2基因型對個體泮托拉唑血藥濃度影響明顯 (圖1)。從給藥后1.0h起,GG基因型與 AA型組間泮托拉唑的血藥濃度存在明顯差異,表明CYP2C19*2與泮托拉唑代謝密切相關(guān)。

本研究中 CYP2C19*2AA與 GG基因型的 t1/2,Cmax及AUC比較,分別為1.77、2.12和4.68倍表明不同基因型對血藥濃度影響較大,本研究結(jié)果與文獻(xiàn)[6,1]報道結(jié)果基本一致。

以上試驗(yàn)結(jié)果表明:CYP2C19*2基因是泮托拉唑藥代動力學(xué)的關(guān)鍵決定因素,泮托拉唑在突變純合子(AA基因型)個體體內(nèi)代謝能力明顯降低。這可能是由于 CYP2C19*2等位基因變異使外顯了5第681位的堿基發(fā)生 G→ A變異,形成一個異常剪切位點(diǎn),使得在轉(zhuǎn)錄時外顯了5的起始端丟失了40個堿基對,從而在核糖體翻譯時丟失了215→ 227位的氨基酸,進(jìn)而使得215位氨基酸開頭的閱讀框架發(fā)生移動,因此在215位氨基酸下游的第 20個氮基酸處提前產(chǎn)生了1個終止密碼子,使得蛋白合成過早被終止,其結(jié)果使這一截短的含234個氨基酸的蛋白失去了催化活性[7],因此對底物的代謝能力大幅度下降。

泮托拉唑的含量測定方法很多,我們曾采用文獻(xiàn)[8]報道方法檢測,但其對于體內(nèi)藥物的檢測在靈敏度與重復(fù)性方面差異較大,經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn),最終采用了本文的方法。

綜上所述,本文在健康受試者中研究了 CYP2C 19*基因多態(tài)性對泮托拉唑代謝動力學(xué)的影響,我們認(rèn)為CYP2C19*2基因是泮托拉唑體內(nèi)動力學(xué)過程重要決定因素,是泮托拉唑藥物治療效應(yīng)與不良反應(yīng)個體間差異的重要因素。因此,泮托拉唑給藥治療前進(jìn)行 CYP2C19*2等基因分型,結(jié)合血漿藥物濃度監(jiān)測,可優(yōu)化個體治療方案,提高臨床療效,降低不良反應(yīng)。

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