王鳳玲,張廣萍,張亞玲,孫云暉

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003)

WWOX基因是由 Bednarek等在2000年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的脆性位點(diǎn)(CFSs)基因。有研究指出,WWOX蛋白主要位于線粒體。WWOX受多種凋亡應(yīng)激因素影響,其作用可造成線粒體通透性改變,WWOX蛋白合成增加,同時(shí)這些凋亡應(yīng)激因素還能使得 WW結(jié)構(gòu)域中的 Try33磷酸化,WWOX蛋白發(fā)生轉(zhuǎn)位[2],上調(diào) P53,下調(diào) Bcl-2、Bcl-xl,增強(qiáng) TRADD介導(dǎo)的細(xì)胞死亡及 TN F介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。由此可知 WWOX基因可作為一種促凋亡蛋白發(fā)揮作用,它與 P53共同發(fā)揮作用,且在介導(dǎo)凋亡的過程中能產(chǎn)生協(xié)同作用,二者是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的配偶體。

國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道食管癌,鼻炎癌,卵巢癌,胃癌等的腫瘤中均有 WWOX及 P53的表達(dá),但在肺癌組織中的表達(dá)報(bào)道較少,故本課題應(yīng)用免疫組化方法檢測 WWOX及 P53在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá),通過探討其在肺癌中的表達(dá)情況,為肺癌診斷、治療、判斷預(yù)后提供有意義的生物學(xué)指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

實(shí)驗(yàn)組:取佳大附屬第一醫(yī)院胸心外科手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)為肺癌的病理標(biāo)本40例,所有患者術(shù)前均未接受化療、放療和其他治療。臨床分期采用美國癌癥分類委員會(huì)(AJCC)和國際抗癌聯(lián)盟(UICC)2002年制定的 TNM分期。

對(duì)照組:取同組病例距癌組織邊緣5cm以上的正常肺組織作為對(duì)照組。

1.2 試劑

①兔抗人 WWOX多克隆抗體;②兔抗人 P53單克隆抗體;③即用型 UltraSensitiveTM S-P試劑盒濃縮型;④ DAB試劑盒;⑤磷酸鹽緩沖液 PBS(0.01mol/L,pH7.2～7.4)粉劑。試劑均購自美國美國 Santa Cruz公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

肺癌標(biāo)本經(jīng)固定、常規(guī)石蠟包埋后切片,供常規(guī) HE染色和免疫組織化學(xué)染色。WWOX工作液配比濃度為1：150,P53工作液配比濃度為1：100。各步驟嚴(yán)格按照檢測試劑盒說明進(jìn)行。

1.4 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

兩種蛋白染色陽性均為黃色至棕黃色顆粒,WWOX陽性表達(dá)定位于細(xì)胞胞質(zhì) ,P53定位于細(xì)胞核。P53的判斷標(biāo)準(zhǔn):觀察10個(gè)高倍視野(10×40)內(nèi)細(xì)胞計(jì)數(shù),視野內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)在25%以下者為陰性,介于25%～50%為弱陽性,50%以上為強(qiáng)陽性。WWOX的判斷標(biāo)準(zhǔn):①按染色強(qiáng)度計(jì)分:無著色為0分,淡黃色為1分 ,棕黃色為 2分。②按陽性細(xì)胞百分比計(jì)分:著色細(xì)胞 ＜10%為 0分,10%～39%為 1分,40%～69%為 2分,＞70%為3分。③將兩者相加總計(jì)分:0分為陰性,1～ 3分為弱陽性,4分以上為強(qiáng)陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件,采用i2檢驗(yàn),等級(jí)分析采用Mann-Whitney非參數(shù)檢驗(yàn),P ＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 WWOX蛋白在 NSCLC組織和正常肺組織中的表達(dá)

WWOX在實(shí)驗(yàn)組中失表達(dá)者為 30例 ,失表達(dá)率為75%,在對(duì)照組中失表達(dá)者為20例,失表達(dá)率為 50%,WWOX在實(shí)驗(yàn)組中的失表達(dá)率顯著高于對(duì)照組 (P＜0.05)。

2.2 P53蛋白在 N SCLC組織和正常肺組織中的表達(dá)情況

P53在實(shí)驗(yàn)組中陽性表達(dá)為23例 ,陽性表達(dá)率 57.5%,在對(duì)照組中陽性表達(dá)為8例,陽性表達(dá)率為 20%,P53在實(shí)驗(yàn)組中的陽性表達(dá)率顯著高于對(duì)照組 (P＜0.01)。

表1 WWOX基因的表達(dá)與各臨床病理因素的關(guān)系

表2 P53的表達(dá)與各臨床病理因素的關(guān)系

2.3 WWOX蛋白和 P53蛋白在 NSCLC組織中的表達(dá)與NSCLC各臨床病理因素的關(guān)系

WWOX的表達(dá)與病理類型、細(xì)胞分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P ＜0.05)。P53的表達(dá)與組織分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān) (P ＜ 0.05)。 (見表 1～2)

2.4 WWOX及 P53在 N SCLC中表達(dá)的相關(guān)性分析

WWOX與 P53表達(dá)負(fù)相關(guān),兩組相關(guān)系數(shù)為-0.49。(見表 3,圖 1)

表3 WWOX及 P53在 N SCLC中表達(dá)的相關(guān)性分析

圖1 WWOX陽性表達(dá)、陰性表達(dá)與 P53陽性表達(dá)的關(guān)系

3 討論

通過我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) WWOX的表達(dá)缺失與非小細(xì)胞肺癌有關(guān),癌旁正常組織中 WWOX的失表達(dá)率明顯低于NSCLC中 WWOX蛋白的失表達(dá)率,因此我們認(rèn)為 WWOX蛋白有可能參與調(diào)控肺癌的發(fā)生發(fā)展。

近年來人們對(duì) P53的結(jié)構(gòu)及功能進(jìn)行了更深入的探討,隨著越來越多的實(shí)驗(yàn)研究及臨床研究,人們對(duì)這種基因有了更深刻的了解,突變型的 P53[3]具有抑制細(xì)胞凋亡的特性,且其性質(zhì)穩(wěn)定,易被免疫組化方法檢出,故常被應(yīng)用于各種實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)也選用了突變型 P53作為檢測指標(biāo),實(shí)驗(yàn)證明在 40例 NSCLC組織中,23例癌細(xì)胞 P53呈陽性表達(dá) ,此外本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),P53的表達(dá)與組織分化、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

WWOX對(duì) P53的作用可表現(xiàn)為結(jié)合穩(wěn)定性 P53,WWOX作用于 P53可以控制 P53的活性、結(jié)構(gòu)的變化、核轉(zhuǎn)錄等,抑制凋亡的發(fā)生,我們的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示 WWOX、P53均與組織分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),也進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn),因此本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了 WWOX蛋白與 P53蛋白可作為肺癌的診斷和判斷預(yù)后的重要依據(jù)。但以上二種基因之間相互作用的具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

[1]Bednarek AK,Laflin KJ,Daniel RL,et al.WWOX,a nov el WW domain-containing protein mapping to human chromosome16q23.3-24.1,aregion frequently affected in breast cancer[J].Cancer Res,2000,60:2140-2145

[2]Ludes-Meyers JH,Bednarek AK,Popescu NC,et al.WWOX,the common chromosomal fra-gile site,FRA16D,Cancer Gene[J].Cytogenetic Genome Res,2003,100(1-4):101-110

[3]Tokino T,Nakamura Y.The role of p53-target genes in human cancer[J].Oncology/Hematology,2000,33(1):1-6