楊 寧,王 麗

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科,黑龍江 佳木斯 154003)

老化、外傷、遺傳、代謝異常、輻射、中毒和局部營(yíng)養(yǎng)不良等因素是引起晶狀體囊膜損傷的罪魁禍?zhǔn)?使其滲透性增加,從而失去屏障作用,或?qū)е戮铙w代謝紊亂,使晶狀體蛋白發(fā)生變性,形成混濁逐步發(fā)展成為白內(nèi)障。自由基引起的晶狀體氧化損傷及生化改變是對(duì)晶狀體產(chǎn)生損傷的主要機(jī)制。目前報(bào)道有抗氧化作用的中藥有人參、三七、黃芪、靈子等。國(guó)內(nèi)研究顯示人參的乙酸乙酯及水提取物抗氧化活性較高,研究顯示抗氧化活性為中等及中等極性化合物。人參總皂甙是從五加科植物人參的根、莖葉中提取精制而成。體外實(shí)驗(yàn)顯示人參皂甙可以明顯抑制腦和肝中過氧化脂質(zhì)形成,減少大腦皮層和肝中脂褐素的含量,同時(shí)也能增加超氧化物歧化酶和過氧化氫酶在血液中的含量,具有抗氧化作用。本實(shí)驗(yàn)主要探討人參總皂甙對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的大鼠白內(nèi)障的預(yù)防作用,為以后預(yù)防白內(nèi)障新藥的系列開發(fā)奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:清潔級(jí) SD大鼠15只,雌雄各半,體重(18±2)g,購于哈爾濱中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。大鼠飼養(yǎng)于隔離籠內(nèi)(頂部有空氣過濾膜),飲用水和飼料均經(jīng)高壓滅菌處理,寄養(yǎng)于佳木斯大學(xué)動(dòng)物中心清潔級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)。

1.1.2 試劑與儀器

試劑鹽酸川芎嗪注射液廣州南國(guó)制藥廠;30%H2O2溶液南昌市東湖青山試劑助劑廠;復(fù)方托吡卡胺滴眼液參天制藥株式會(huì)社;人參總甙廣東省惠州市東方科技有限公司;超凈工作臺(tái)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;眼科顯微手術(shù)器械蘇州器械六廠;二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱丹東市醫(yī)療器械廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法及步驟

1.2.1 大鼠的分組,模型準(zhǔn)備、用藥情況

準(zhǔn)備健康大鼠共18只,可提高晶狀體36個(gè)。首先使用復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳,瞳孔散大后置于裂隙燈顯微鏡下觀察晶狀體是否混濁,需取透明晶狀體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將大鼠處死,摘除眼球,將眼球放入 75%酒精浸泡消毒,后放入含慶大霉素 320000U/L的滅菌 PBS中15min。在無菌工作臺(tái)上,使用解剖顯微鏡從球后視乳頭處剖開眼球,除去除晶狀體的所有組織,剝離肌肉及韌帶,用撈勺將晶狀體取出放入盛有30mL RPMI-1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中。每培養(yǎng)皿放 3個(gè)晶狀體,于36.8℃、5.0%二氧化碳、設(shè)定培養(yǎng)箱濕度為95%,預(yù)孵4h,因人為操作不當(dāng)造成6個(gè)晶狀體混濁已被去除。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組情況與晶狀體培養(yǎng)程度

參照王勇報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法(經(jīng)過改進(jìn):將 Medium199培養(yǎng)液換為 RPM I-1640細(xì)胞培養(yǎng)基)將晶狀體用取出,并未經(jīng)過排列放入不同條件培養(yǎng)液中。1,2,3每組7個(gè)晶狀體,4,5每組放入 6個(gè)晶狀體,分組如下 (其中 H2O2組是模型組):空白對(duì)照組:RPM I-1640培養(yǎng)液30mL,含有青霉素注射液100U/mL、鏈霉素注射液 100U/mL H2O2組:對(duì)照組培養(yǎng)液除外,另外加入 30% 過氧化氫 1.0μL(H2O2終濃度為300.0 μmol/L),川芎嗪組:除 H2O2組各成分之外,另加鹽酸川芎嗪30mL。

1.2.3 觀察晶狀體的混濁的程度及分級(jí)

在培養(yǎng)完成之后對(duì)晶狀體逐一進(jìn)行拍照。在淺色背景下安排一組寬度為0.5mL,距離2.5mL的深色線條呈交叉垂直狀態(tài),培養(yǎng)完成后將各組大鼠晶狀體放入“+”字交叉的深色線條上面,通過觀察透過晶狀體顯示出的線條清晰度,用這種方法進(jìn)行分級(jí)。比較每個(gè)實(shí)驗(yàn)組間 /內(nèi)的晶狀體混濁的程度不同。

“-”:線條可見并清晰,為透明不混濁晶狀體;計(jì) 0分;“+ ”混濁:線條模糊不清 ,但是輪廓大致可見;計(jì) 1.0分;“++”混濁:線條輪廓極不清楚,僅中央部分略微可以觀察到;計(jì) 2.0分;“+++”混濁:線條完全不見,晶狀體呈全部混濁,計(jì) 3.0分。

1.2.4 測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)

實(shí)驗(yàn)測(cè)定原理:通過黃嘌呤氧化酶及黃嘌呤二者反應(yīng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基,硝酸鹽由前者氧化羥胺形成,在顯色劑的條件下顯現(xiàn)為紫紅色。當(dāng)測(cè)試樣品中含有 SOD時(shí),則對(duì)超氧陰離子自由基有唯一性的抑制功能,使亞硝酸鹽形成逐漸減少,利用計(jì)算公式可計(jì)算出被測(cè)樣品中的 SOD活力。用比色法測(cè)定 SOD活性,將測(cè)定管和對(duì)照管分別裝入試劑一1.0mL和試劑二、試劑三、試劑四各 0.1mL,測(cè)定管加入樣品0.1mL,對(duì)照管加入蒸餾水 0.1mL。用旋渦混勻器充分混勻,置37℃恒溫水浴40min后對(duì)照管測(cè)定管各加入顯色劑2mL,將各管混勻 ,室溫放置 10min,于波長(zhǎng) 550nm處,1cm光徑比色杯,蒸餾水調(diào)零,比色測(cè)各管 OD值。

計(jì)算公式為:組織勻漿中 SOD活力(U/mgprot)=

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS18.0軟件以 P ＜0.05顯示具有顯著差異。

2 結(jié)果

在晶體抗氧化酶活方面人參總甙組高于空白對(duì)照組,而低于陽性對(duì)照組,具有顯著差異 (P ＜0.05),見表1。

表1 培養(yǎng)24h后各組晶狀體抗氧化酶活性 (±s,n=6)

表1 培養(yǎng)24h后各組晶狀體抗氧化酶活性 (±s,n=6)

組 別 SOD活性空白組 38.12±1.86過氧化氫組 9.24±0.58人參總甙組 23.15±1.46

3 討論

人參總甙對(duì)鼠白內(nèi)障的發(fā)生、發(fā)展有一定的預(yù)防作用,應(yīng)進(jìn)一步深入研究。中醫(yī)藥創(chuàng)新研究是我國(guó)最具原始創(chuàng)新潛力的領(lǐng)域,近年來我國(guó)中藥產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展,已初步形成了一定規(guī)模的產(chǎn)業(yè)體系,成為我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)極具發(fā)展優(yōu)勢(shì)和市場(chǎng)前景的戰(zhàn)略性產(chǎn)業(yè)。人參素有“百草藥”的美譽(yù),在中醫(yī)藥領(lǐng)域已有兩千對(duì)年的應(yīng)用歷史。目前在人參的創(chuàng)新研究過程中,關(guān)于人參抗氧化方面的研究有諸多報(bào)道。國(guó)內(nèi)周才瓊等[2]人的研究顯示人參的乙酸乙酯及水提取物抗氧化活性較高,研究顯示抗氧化活性為中等及中等極性化合物。例如有學(xué)者報(bào)道[3]人參可以抑制 SO2引發(fā)的肝臟的超氧化物歧化酶、過氧化物酶及過氧化氫酶下降和丙二醛的升高,對(duì) SO2引發(fā)的肝臟損傷有一定的防護(hù)作用。馬中春[4]等人的研究顯示人參膠囊具有降低雄性老年大鼠血清中過氧化脂質(zhì) MDA含量、升高血清中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)的作用,提示人參膠囊在抗氧化領(lǐng)域用很好的應(yīng)用前景。張嘉麟[5]等人的研究顯示小鼠紅細(xì)胞中超氧化物歧化酶(SOD)的活力可以被人參總皂甙可以提高,說明人參總皂甙具有很強(qiáng)的抗氧化活性,在抗衰老方面有一定的應(yīng)用價(jià)值。

[1]劉宏偉,劉遠(yuǎn)光.高溫氧化條件下人晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)HSP70mRN A的表達(dá) [J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2008,31(4):19

[2]ZHOU Cai-qiong,ZHANG Bao-yong.Study on anti-oxidation of Indian ginseng in vitro[J].Science and Technology of Food Industry,2008,02:4-8

[3]Ai Y,Zheng Z,O'Brien- Jenkins A,et al.A mouse model of galactose-induced cataracts[J].Hum Mol Genet,2000,22(12):1821-1827

[4]馬中春.人參膠囊降低雄性老年大鼠血清中過氧化脂質(zhì) M DA含量、升高血清中谷胱甘肽過氧化物酶研究進(jìn)展 [J].眼科新進(jìn)展,2003,23(1):52-55

[5]張嘉麟.三七中人參皂甙對(duì)老年鼠血液中抗氧化酶活力影響的研究 [J].昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2005,25(4):308-309