梁衍鋒,張東東,孫俐俐,倪 蕾,劉君星,王芳芳,房艷春,王淑秋,馬小茹,劉 蕾,吳佳梅

(1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江佳木斯 154007;2.大慶市油田總醫(yī)院,黑龍江 大慶 163000;3.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯154003)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,N AFLD)是最常見的慢性肝臟疾病,以肝細(xì)胞脂肪變性和脂肪沉積為病理特征,無過量飲酒史、病毒感染或其它特定病原體的臨床綜合征[1,2]。N AFLD是一種遺傳-環(huán)境-代謝應(yīng)激相關(guān)性疾病[3],發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。載脂蛋白 B(apolipoprotein B,ApoB)由肝臟合成 ,是低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的主要結(jié)構(gòu)蛋白,與 LDL關(guān)系密切 ,在 N AFLD的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。

姜黃素(curcumin)和靈芝(ganoderma lucidum)均具有保肝護(hù)肝作用。姜黃素是從姜科姜黃屬植物姜黃中分離出來的一種具有β-二酮結(jié)構(gòu)的多酚類化合物,其使用歷史悠久[4]。靈芝是一種珍貴的藥用真菌,具有多種藥用價(jià)值。靈芝孢子為其發(fā)育后期彈射釋放出的種子,其主要成分與靈芝相似,但其有效成分的種類和含量均高于靈芝子實(shí)體[5]。有報(bào)道顯示[6]靈芝飽子能顯著降低 D-氨基半乳糖所致小鼠血清ALT和 AST,并有效減輕甚至防止小鼠肝損傷;對注射四氯化碳引起的血清 ALT升高及肝臟甘油三脂的蓄積均有明顯降低作用。本實(shí)驗(yàn)在姜黃素和靈芝孢子保肝護(hù)肝作用的基礎(chǔ)上研究其對 NAFLD小鼠肝臟 ApoB100表達(dá)的影響,從基因水平探討姜黃素及靈芝孢子治療 N AFLD的機(jī)制,并對比兩種藥物的治療效果。

1 材料和方法

1.1 材料

姜黃素,質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%。靈芝孢子,由藥物研究所提供。瓊脂糖(美國 Sigma公司),引物、GAPDH、DEPC、RNA提取試劑盒(上海生物工程技術(shù)有限公司),TAKARA RNAiso Plus、Taq DN A聚合酶、DL1000DNA Marker、 TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型及分組:將60只昆明種雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后,隨機(jī)分為4組(正常組、N AFLD模型組、姜黃素治療組、靈芝孢子治療組),正常組飼正常飲食,其它組飼自制高脂飲食(基礎(chǔ)飼料80.5%,膽固醇 2%,豬油 7%,蛋黃粉 10%及膽鹽0.5%)。4周后姜黃素治療組強(qiáng)飼姜黃素生理鹽水混濁液,靈芝孢子治療組強(qiáng)飼靈芝孢子生理鹽水混濁液,其它兩組采用生理鹽水代替。12周后取材,HE染色觀察肝臟變化。

1.2.2 RT-PCR:RNA提取及反轉(zhuǎn)錄使用的所有器具均經(jīng)酸浸過夜,沖凈后 DEPC水浸泡過夜,高溫高壓滅菌后烤干密封保存?zhèn)溆谩?/p>

(1)提取總 RN A并檢測其質(zhì)量:取肝組織加入適量RN Aiso Plus勻漿,12,000g 4℃離心 5min,取上清液加入氯仿振蕩。12,000g 4℃離心15min。取上層水相加入等體積異丙醇,12,000g 4℃離心10min。棄上清,清洗 RN A沉淀。室溫干燥后加入 RNase-free水溶解,確定 RNA純度和濃度 ,瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA的完整性,-80℃保存。

(2)反轉(zhuǎn)錄:依據(jù)試劑反應(yīng)體系對提取的 mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄后的 cDNA-20℃保存。

(3)PCR引物序列為:ApoB100基因 上游引物:5’-TCGAGCACAGATGACCAGAGT-3’,下 游 引 物:5’-CTTAGAAGCCTTGGGCACAT-3’擴(kuò)增片斷長度為201bp; GAPDH 上 游 引 物: 5’ -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’,下 游 引 物:5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’擴(kuò)增片斷長度為452bp。PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳,凝膠成像系統(tǒng)觀察并保存。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

表1 4組動(dòng)物肝臟組織 ApoB100 mRNA半定量分析結(jié)果 (±s,n=15)

表1 4組動(dòng)物肝臟組織 ApoB100 mRNA半定量分析結(jié)果 (±s,n=15)

分組 ApoB100/GAPDH正常組 0.74±0.05 N AFLD模型組 0.96±0.05姜黃素治療組 0.80±0.04靈芝孢子治療組 0.83±0.01

圖1 正常組、NAFLD模型組 ApoB100、GAPDH mRNA的 RT-PCR反應(yīng)條帶

圖2 姜黃素治療組 ApoB100、GAPDHmRNA的 RT-PCR反應(yīng)條帶

圖3 靈芝孢子治療組 ApoB100、GAPDH mRNA的 RT-PCR反應(yīng)條帶

2 結(jié)果

ApoB100 mRN A檢測結(jié)果:如圖 1、圖 2、圖 3所示 ,正常組、NAFLD模型組、姜黃素治療組、靈芝孢子治療組均可在201bp,452bp見 ApoB100及 GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物條帶,與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物長度吻合。掃描圖像凈光密度數(shù)值經(jīng)過方差分析顯示,動(dòng)物肝臟組織 ApoB100mRN A在模型組表達(dá)增高,姜黃素治療組和靈芝孢子治療組表達(dá)均降低。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析正常組、模型組、姜黃素治療組之間相比較差異有極顯著性意義 (P＜0.01);組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P ＜0.05)。正常組、模型組、靈芝孢子治療組之間相比較差異有極顯著性意義 (P＜0.01);組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。姜黃素治療組與靈芝孢子治療組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞ 0.05)。

3 討論

ApoB存在于低密度脂蛋白(LDL)表面,細(xì)胞識(shí)別和攝取 LDL主要通過識(shí)別 ApoB來實(shí)現(xiàn)[7]。ApoB由肝臟合成,是低密度脂蛋白膽固醇的主要結(jié)構(gòu)蛋白,有 ApoB100和ApoB48兩個(gè)類型 ,ApoB100與 LDL的關(guān)系更為密切[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,N AFLD模型組與正常組比較,ApoB100 mRN A的表達(dá)顯著增高,差異有顯著性 (P ＜0.05)。說明N AFLD模型組肝臟中 ApoB100mRNA的表達(dá)明顯增高,這可能與高脂飲食導(dǎo)致血脂增高有關(guān)。姜黃素治療組和靈芝孢子治療組與模型組相比較肝臟 ApoB100 mRNA表達(dá)均降低,但仍高于正常組,差異有顯著性 (P ＜0.05)。說明應(yīng)用姜黃素和靈芝孢子治療 NAFLD均得到一定的效果,二者均可通過降低肝臟中 ApoB100 mRN A的表達(dá)調(diào)節(jié)小鼠肝臟脂代謝。姜黃素治療組與靈芝孢子治療組相比較肝臟 ApoB100 mRN A的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示姜黃素與靈芝孢子對于小鼠 NAFLD治療效果無明顯差異。

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