李維善,朱建華,姜景紅

(佳木斯大學附屬口腔醫(yī)院牙周黏膜病科,黑龍江 佳木斯 154002)

口腔白斑病(oral leukoplakia OLK)是口腔黏膜上的白色斑塊或斑片,世界衛(wèi)生組織(W HO)將其歸入癌前病變 ,雖然目前其病因不明,白斑發(fā)病與局部因素的長期刺激及某些全身因素有關(guān)?？咕氖菑V泛存在于自然界的一類生物源性多肽,具有廣泛的抗細菌、抗病毒、抗真菌及抗腫瘤等活性,主要存在于人類黏膜組織中的抗菌肽是防御素家族和Cathelicidins家族[1]。人類 β- 防御素 (human β-defensins,hBDs)是防御素家族中的重要成員之一,其中防御素 HBD-2因其具有高效的殺菌活性,同時在口腔上皮天然免疫的作用而備受關(guān)注。因此,本研究通過免疫組化方法檢測 OLK患者病損中防御素 HBD-2的表達水平,探討防御素 HBD-2在 OLK致病過程中的作用以及與癌前病變的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入2011～2012年在佳木斯大學附屬口腔醫(yī)院 OLK患者 8例,經(jīng)病 理科 HE染色確診 ,其中男 6例 ,女 2例;年齡 47～62歲,病程3個月～2年,病損部位均為頰黏膜,臨床上為均質(zhì)型白斑,8例患者均排除全身系統(tǒng)性疾病,且在前 3個月內(nèi)均未接受過任何治療。對照組 6例為正?？谇火つそM織,來源于本院口腔頜面手術(shù)病例,其中男女各3例,年齡 23～61歲。病理組織切片的納入標準:研究標本固定良好,相應(yīng)的病理和臨床病例齊全。所有研究對象簽署知情同意書。切取研究對象的病變部位0.5cm大小,于10%中性甲醛固定液中固定后常規(guī)石蠟包埋,4μ m厚超薄連續(xù)切片,用于病理診斷及免疫組化染色檢測。

1.2 免疫組織化學法(IHC)

鼠抗人 HBD-2單克隆抗體(武漢博士德生物技術(shù)有限公司),DAB顯色劑(上?？婆d商貿(mào)有限公司),采用微波修復(fù)抗原的 SP法進行免疫組織化學染色半定量檢測 HBD-2蛋白的表達。將各組標本切片 ,置烤箱 60℃60min使切片緊密粘附,然后二甲苯脫蠟,梯度水化至水,3%過氧化氫液室溫孵育10min,蒸餾水洗3次,微波爐抗原修復(fù),PBS洗滌,血清封閉 ,室溫孵育 20min,不洗 ,HBD-2一抗 (1：50稀釋 )37℃孵育2h或 4℃過夜,PBS漂洗,生物素標記二抗室溫孵育20 min,PBS漂洗,鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物室溫孵育 20min,PBS漂洗,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察并照相?？瞻讓φ掌?PBS代替一抗。以肺泡組織作陽性對照,以細胞深染成個粒狀棕黃色為陽性表達?？瞻讓φ詹捎?PBS替代一抗,陽性對照采用已知陽性片。

1.3 圖像分析

利用彩色圖像分析系統(tǒng)、Image pro-plus 5.1圖像分析軟件,高倍鏡下,每張切片的各個陽性染色的部位隨機選取10個視野,測量其平均吸光度值(average optical density,A值),并選取同張切片的空白區(qū)進行校正。將校正后的平均值作為該片的 A值。利用 SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對各組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。

2 結(jié)果

免疫組化染色結(jié)果 8例口腔白斑病損中和6例對照組織均出現(xiàn)防御素 HBD-2的陽性染色,陽性染色主要表達在細胞漿內(nèi),細胞膜和細胞核未見陽性表達。防御素 HBD-2在對照組和口腔白斑組黏膜組織中的表達情況通過平均吸光度值 A顯示,正常組 8.13±0.46,白斑組 12.56±0.37,顯示HBD-2在對照組、白斑組中的陽性染色表達逐漸增強;使用單因素方差分析結(jié)果顯示,與對照組相比較,HBD-2在白斑組表達陽性強度均明顯增加 (P＜0.01),圖1～ 2。

3 討論

口腔是一個復(fù)雜的環(huán)境,棲息著大量的微生物,口腔黏膜上皮長期經(jīng)受各種微生物的侵襲和一些化學性以及機械性刺激,因此口腔黏膜易發(fā)生感染和其它病損。為保護口腔黏膜免受這些有害物質(zhì)入侵,防止各種口腔黏膜疾病的發(fā)生,口腔黏膜組織中各種免疫細胞和一些抗微生物肽等形成一道防御性屏障,其中防御素是這個屏障的重要組成成分[2]。

防御素 HBD-2在1997年首先從牛皮癬患者的皮膚中分離并純化得到[3],防御素 HBD-2是最早在人體中被發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)可誘導(dǎo)性防御素,可以通過炎癥等刺激因素誘導(dǎo)其表達增加。防御素 HBD-2廣泛分布于口腔頰黏膜、舌黏膜、牙齦等組織,唾液和齦溝液中也有廣泛的分布,具有高度的抗菌活性[4]。HBD-2在口腔上皮天然免疫、腫瘤免疫和獲得性免疫中均發(fā)揮作用[5]。Sawaki等[6]通過免疫組化的方法觀察到 OLP、假絲酵母菌性白斑及白假絲酵母菌病的病變組織中HBD-2的表達均有增強。近年來,口腔的惡性腫瘤的發(fā)病率不斷增加,發(fā)病原因復(fù)雜,其中感染是腫瘤發(fā)病發(fā)展的一個重要促進因素,同時腫瘤患者機體免疫功能紊亂,在各種病原體的侵襲下易發(fā)生感染,在白斑病損中常伴有白色念珠菌感染,且伴白念感染者癌變率增加,本研究結(jié)果顯示,與對照組相比較 HBD-2在白斑病損中的陽性染色呈逐步增強趨勢,與以往的研究結(jié)果一致[7]。防御素 HBD-2是防御素家族的成員之一,參與組成了口腔黏膜的免疫防御體系一部分,在口腔黏膜的免疫防御中發(fā)揮作用。防御素 HBD-2在口腔白斑的發(fā)生和發(fā)展過程中,參與了口腔黏膜和機體的免疫防御反應(yīng),提示其可能與口腔癌前病變有某些聯(lián)系。本研究中白斑患者雖然均已被臨床和病理證實,但是癌變率更高的非均質(zhì)型白斑病例沒有收集到,上皮異常增生程度與白斑病損中 HBD-2表達變化否有關(guān),還要進一步深入的研究。

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