王麗敏,王 蕾,徐海波,張穎杰,張 巖

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科,黑龍江 佳木斯 154003)

腎病綜合征(nephrotic syndrome,N S)是指由多種病因引起的,以大量蛋白尿(24h尿蛋白＞ 0.05g/kg)、低白蛋白血癥(血漿白蛋白 ＜30g/L)、高度水腫、高脂血癥[1]為主要臨床表現(xiàn)的一組綜合征,是兒科臨床常見病、多發(fā)病,微小病變型腎病是兒童腎病綜合征最常見的類型,其病理生理改變?yōu)槟I小球基膜通透性增加伴腎小球?yàn)V過率降低?，F(xiàn)有治療方案以激素為主,存在療程長(zhǎng)、副作用多、易復(fù)發(fā)、患者依從性差等缺點(diǎn),嚴(yán)重威脅患兒的健康。NS的發(fā)病機(jī)制與多種因子有關(guān),NF-KB是參與基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)分子之一,廣泛存在于機(jī)體各種組織細(xì)胞中[2],且當(dāng)細(xì)胞受到外界因素刺激時(shí),胞質(zhì)內(nèi) NF-KB與抑制蛋白(IK-BS)分離并活化,進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與 DN A結(jié)合啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄,調(diào)節(jié)包括細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì) (如 IL-8、 IL-2、 IL-2a、1L-6、V CAM、ICAM、 E-selectin、IFN-B、 MCP-1、RAN TES等 )在內(nèi)的眾多蛋白質(zhì)表達(dá)。IL-8與靶細(xì)胞上特異受體結(jié)合,引起腎小球基底膜硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(分布于細(xì)胞膜與細(xì)胞外基質(zhì)中)分解代謝增加,合成代謝減少,導(dǎo)致腎小球靜電屏障破壞,從而使大量帶負(fù)電荷血漿清蛋白從腎小球基底膜漏出,產(chǎn)生蛋白尿[3]。腎茶又名貓須草,目前已從中分離出熊果酸、迷迭香酸等多種成分。劉勇等[4]研究表示,熊果酸能劑量依賴性的抑制 CD3、CD28單抗促發(fā)的 N F-KB P65細(xì)胞核轉(zhuǎn)位,下調(diào) T細(xì)胞的作用。本研究擬建立阿霉素致 NS大鼠模型,檢測(cè)大鼠外周血中 N F-KB和 IL-8的變化 ,并觀察大鼠尿蛋白的變化及探討腎茶治療 NS的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象:雄性 Wistar大鼠40只,體重為(120±20)g,兩次尿蛋白定性陰性,由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 藥物及試劑:鹽酸阿霉素(浙江省海正藥業(yè)有限股份公司);腎茶(泉州市醫(yī)藥公司);IL-8試劑盒、核蛋白提取試劑盒、NF-KB試劑盒 (美國(guó) Activemotif公司)。

1.1.3 儀器:代謝籠、DNX-9620電腦洗板機(jī)、DNM-9602酶標(biāo)分析儀、電熱恒溫水溫箱、-80℃超低溫冰箱、自動(dòng)旋轉(zhuǎn)振蕩儀、離心機(jī)等均由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 方法

1.2.1 模型制備:大鼠在佳木斯大學(xué)動(dòng)物室適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。隨機(jī)分為兩組:正常組 (n=10)注射生理鹽水 0.5mL,腎病組(n=30)參照王崢等[5]方法尾靜脈單次注射阿霉素5mg/kg(用生理鹽水溶解至0.5mL)制備 NS模型,注射后第7天檢測(cè)所有大鼠24h蛋白尿,尿蛋白＞ 30mg/24h者為 NS模型成功。期間死亡6只,不合格者4只予以剔除。剩余腎病組再隨機(jī)分為兩組:腎病組(n=10)、腎茶組(n=10)。

1.2.2 給藥方法:腎茶組在造模成功后第7天開始灌胃給藥5mL/kg,正常組和腎病組給予等量生理鹽水灌胃。

1.2.3 各組大鼠24h尿蛋白的測(cè)定:在阿霉素注射后第6、20、41天收集24h尿液,用免疫比濁法檢測(cè)24h尿蛋白。

1.2.4 各組大鼠 NF-KB、 IL-8的測(cè)定:第 7、 21、42天大鼠清晨空腹采靜脈抗凝血2mL,用淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞,PBS制成 2× 106/mL細(xì)胞懸液,用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞提取物 NF-KB;同時(shí)采集非抗凝血1mL,分離血清置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?取其上清液用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法檢測(cè) IL-8。以上步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用 SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件,實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示。三組均數(shù)間比較用隨機(jī)區(qū)組方差分析;兩組均數(shù)間差別用 t檢驗(yàn);相關(guān)分析采用 Pearson直線相關(guān)析。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠尿蛋白比較

見表 1。

表1 各組大鼠尿蛋白定量 (±s,mg/24h,n=10)

表1 各組大鼠尿蛋白定量 (±s,mg/24h,n=10)

注:△與正常組比較 P ＜0.01;★與腎病組比較 P＞ 0.05;●與腎病組比較 P＜0.01。

組 別 7d 21d 42d正常組 6.59± 0.33 6.84± 0.32 7.17± 0.30腎病組 40.85± 1.15△ 101.13± 11.43△ 209.4± 6.20△腎茶組 38.46± 1.26△ 92.65± 7.73△★ 100.3± 4.47△●F值 3617.37 417.87 5246.03

腎病組及腎茶組在第7天尿蛋白均高于正常組(P ＜0.01);腎病組的尿蛋白在第21～42天持續(xù)升高;第21天腎茶組尿蛋白低于同期腎病組,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t= 0.07,P＞ 0.05);第42天腎茶組尿蛋白低于同期腎病組,有顯著性差異 (t=5.71,P＜0.01)。

2.2 各組大鼠 NF-KB活性比較

見表2。

表2 各組大鼠 NF-KB活性 (± s,OD值,n=10)

表2 各組大鼠 NF-KB活性 (± s,OD值,n=10)

注:△與正常組比較 P＜0.01;★ 與腎病組比較 P＞ 0.05;● 與腎病組比較 P＜0.01。

組 別 7d 21d 42d正常組 0.168± 0.032 0.298± 0.034 0.302±0.022腎病組 0.406± 0.022△ 0.510± 0.051△ 0.721±0.031△腎茶組 0.345± 0.032△ 0.492± 0.024△★ 0.602±0.039△●F值 179.022 95.222 477.290

腎病組及腎茶組在第 7天 N F-KB均高于正常組(P ＜0.01);腎病組的 NF-KB在第21～42天持續(xù)升高;第21天腎茶組 N F-KB低于同期腎病組,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t= 0.32,P＞ 0.05);第42天腎茶組 NF-KB低于同期腎病組,有顯著性差異 (t=6.54,P＜0.01)。

3.3 各組大鼠 IL-8濃度比較

見表3。

表3 各組大鼠 IL-8濃度 (±s,pg/mL,n=10)

表3 各組大鼠 IL-8濃度 (±s,pg/mL,n=10)

注:△與正常組比較 P＜0.01;★ 與腎病組比較 P＞ 0.05;● 與腎病組比較 P＜0.01。

組別 7d 21d 42d正常組 2825± 101 3174± 87 3410± 120腎病組 3759± 75△ 3955± 274△ 601± 68△腎茶組 3509± 72△ 3754± 241△★ 3872± 49△●F值 334 354 507

腎病組及腎茶組在第 7天 IL-8均高于正常組(P ＜0.01);腎病組的 IL-8在第21天至 42天持續(xù)升高;第21天腎茶組 IL- 8低于同期腎病組,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t= 0.08,P＞ 0.05);第42天腎茶組 IL-8低于同期腎病組,有顯著性差異 (t= 3.42,P＜0.01)。

3.4 尿蛋白、NF-KB和 IL-8之間的相關(guān)分析

腎病組和腎茶組各組的 N F-KB與 IL-8具有相關(guān)關(guān)系 (r= 0.969,0.870,P均 ＜0.01);正常組 NF-KB與 IL-8不具有相關(guān)關(guān)系 (r= 0.160,P＞ 0.05)。腎病組和腎茶組各組的尿蛋白與 IL-8具有相關(guān)關(guān)系 (r=0.972,0.874,P均 ＜0.01);正常組尿蛋白與 IL-8不具有相關(guān)關(guān)系(r= 0.062,P ＞ 0.05)。

4 討論

微小病變型腎病以腎小球基膜通透性增加伴腎小球?yàn)V過率降低為主要病理改變,大量蛋白尿?yàn)橹饕R床表現(xiàn)。長(zhǎng)期大量蛋白尿可加重腎臟的損害,故減少尿蛋白對(duì)治療腎病綜合征至關(guān)重要。以往研究表明,IL-8與靶細(xì)胞上特異受體結(jié)合后可破壞腎小球基底膜電荷屏障,導(dǎo)致大量蛋白尿的產(chǎn)生。這與本實(shí)驗(yàn)研究相一致,腎病組尿蛋白與正常組和腎茶組有顯著性差異 (P＜0.01),且腎病組的 IL-8與尿蛋白具有相關(guān)性 (P＜0.01)。另有國(guó)外研究報(bào)道[6],腎病綜合征患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中 N F-KB活性與血漿 IL-8濃度呈正相關(guān)趨勢(shì)。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致,說明在 N S病理狀態(tài)下 NF-KB活性水平與 IL-8含量呈直線相關(guān)關(guān)系 (P＜0.01)。鐘桴等[7]研究發(fā)現(xiàn),腎病患兒 NF- KB活性高于正常兒童,提示原發(fā)性腎病綜合征 NF- KB信號(hào)途徑過度活化。NF-KB的激活是許多病理狀態(tài)的決定因素,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)等[8],且 NF-KB活性的增加可引起其下游因子之一 IL-8的濃度增加,故通過抑制 NF-KB活性水平逐漸成為相關(guān)疾病的治療靶點(diǎn),預(yù)期可阻斷疾病的發(fā)生和發(fā)展[9]。

本研究發(fā)現(xiàn),腎病大鼠 NF-KB及其下游因子之一 IL-8明顯增高,尿蛋白與正常組大鼠也有顯著性差異,三者之間具有直線相關(guān)關(guān)系,提示通過抑制 N F-KB活性可降低腎病大鼠的尿蛋白,從而為治療 NS提供新的途徑,這與鐘桴等[7]研究相一致。大量文獻(xiàn)報(bào)道[10],腎茶具有利尿,抗炎 ,抗菌,免疫調(diào)節(jié)等作用。本實(shí)驗(yàn)以腎茶為治療組,結(jié)果顯示腎茶組的 NF-KB比腎病組明顯減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這與劉勇[4]等研究結(jié)果相一致,且腎茶組大鼠尿蛋白明顯低于腎病組,故腎茶可為治療 NS提供新的途徑。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)通過腎茶抑制 N F-KB而抑制其下游因子之一 IL-8,從而減少尿蛋白的產(chǎn)生,治療腎病綜合癥。腎茶為單味中藥,且對(duì)呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)無明顯影響 ,循環(huán)系統(tǒng)[11]研究中,僅對(duì)麻醉犬的血壓有暫時(shí)的降低作用,副作用小,故腎茶可為治療 N S提供新的治療途徑。但由于本實(shí)驗(yàn)周期短,檢測(cè)指標(biāo)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物例數(shù)有限,且 NS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,影響疾病發(fā)展的因素眾多,不易干預(yù)治療,故本實(shí)驗(yàn)僅為初步研究階段。且 NF-KB在體內(nèi)執(zhí)行生理功能方面具有重要作用,也是機(jī)體正常防御和修復(fù)的重要機(jī)制。因此 ,尋求合理的給藥間隔、方式、劑量,是否聯(lián)合應(yīng)用激素能更有效、適當(dāng)抑制 NF-KB,減少尿蛋白從而治療腎病綜合征等一系列問題,將有待于以后的繼續(xù)研究。

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