劉 爽,劉占領(lǐng),張淑紅,張 輝,侯 杰,羅 蘭,魏 巍

(佳木斯大學,黑龍江 佳木斯 154007)

細胞外基質(zhì)磷酸糖蛋白 (matrixextracellular phosphoglyc oprotein,MEPE)最早由 Rowe等從骨骼惡性腫瘤的 cDN A文庫中發(fā)現(xiàn)[1]。MEPE蛋白是小型 N端連接整合素家族蛋白(small integrin-binding ligand N-linked Glycoproteins,SBLIN G)成員,因其某些特異保守區(qū)域與SBLING家族蛋白高度同源,例如 MEPE的C端一段酸性富含絲氨酸-天冬氨酸 MEPE相關(guān)基序(acidic serineaspartate-rich MEPE-associated moti,f ASARM motif),該序列是 SBLIN G家族蛋白的共同特征。且 MEPE與SBLING家族蛋白都定位于4號染色體長臂特定區(qū)域(4q21.1),形成基因簇,參與基質(zhì)鈣化及調(diào)節(jié)成骨細胞與破骨細胞功能[2,3]。隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn) MEPE的功能遠超出最初對 MEPE蛋白的理解,其功能包括如調(diào)節(jié)骨牙代謝、參與細胞 DN A損傷應答、凋亡調(diào)節(jié)及腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本文檢測MEPE蛋白對細胞增殖能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞、菌株及載體

細胞株與質(zhì)粒 MEPE cDN A質(zhì)粒由美國 EMORY大學王亞教授饋贈。293T細胞株購自上海中國科學院細胞研究所。質(zhì)粒 pLEGFP-N 1為 BD Biosciences Clontech公司產(chǎn)品,大腸桿菌 E.coli DH5 T由本室保存。

1.2 主要試劑

PCR產(chǎn)物純化采用 BIO101公司提供的 Geneclean I I試劑盒(Cat# 1001-400);質(zhì)粒提取采用 Qiagen公司QIAprep質(zhì)粒提取試劑盒;限制性內(nèi)切酶及 T4DN A連接酶購自 Takara生物公司。

1.3 PCR擴增、表達質(zhì)粒的構(gòu)建及序列測定

由質(zhì)粒上擴增出 MEPE cDN A全長,所用擴增引物為:上游引 物:5′-CATATGAAGC TGAATGAAGAT-3′,下游引 物:3′-GGATCCTTA CAT TTGGGGGAGATG-3′,PCR擴增的目的基因經(jīng) N de I與 BamH I雙酶切后 ,克隆到經(jīng)過同樣酶切處理的 pLEGFP-N 1載體上,得到融合表達質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 DH5 T挑取單克隆進行 PCR篩選,選1～2個陽性克隆進行測序,鑒定序列及讀碼框架是否正確。

1.4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株構(gòu)建

在細胞生長狀態(tài)良好,融合率達90%～95%時進行轉(zhuǎn)染。按照 Lipofectamin2000操作手冊轉(zhuǎn)染六孔板內(nèi)細胞。轉(zhuǎn)染48h后消化、重懸細胞,10倍稀釋后鋪 96孔板,每孔分別加入800_g/mL G418完全培養(yǎng)基進行克隆篩選,4周后選擇陽性細胞克隆進行鑒定、擴增培養(yǎng)凍存。

1.5 MT T檢測增殖能力

將生長密度達80%的293T細胞,常規(guī)胰酶消化、計數(shù),以5×103密度的細胞200_L接種于96孔板。目的基因組、空載體組 ,每組3個復孔。置于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)1、3、5及 7d后,每孔吸出100_L培養(yǎng)基后每孔再加入10_L MTT(5mg/mL),培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育。4h后,吸去孔內(nèi)液體,每孔加入200_L二甲基亞砜溶解沉淀。選擇490nm波長,在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸光度值并記錄結(jié)果。

1.6 RT-PCR檢測

按照北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司總 RN A提取試劑的說明書 ,用 Trizol提取細胞總 RN A。所用的實驗器具使用前均需用 DEPC水浸泡過夜,去除 RN A酶。RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染細胞中 p53基因的表達。p53引物上游:

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株檢測結(jié)果

提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株總 RN A,進行 RT-PCR,電泳結(jié)果顯示兩組細胞87bp左右均可見 GAPDH擴增條帶出現(xiàn);轉(zhuǎn)染目的基因細胞在110bp處見擴增條帶;空載體組在110bp處無擴增條帶出現(xiàn),證明轉(zhuǎn)染成功,細胞可用于后續(xù)試驗。見圖1。

圖1 pLEGFP-N 1-mepe轉(zhuǎn)染細胞及 pLEGFP-N 1轉(zhuǎn)染細胞RT-PCR電泳圖

1:DL 500DN Amarker;2-3:轉(zhuǎn)染目的基因及空載體細胞中 GAPDH表達;4:轉(zhuǎn)染 M EPE質(zhì)粒細胞中 MEPE表達;5:轉(zhuǎn)染 EGFP細胞中MEPE表達。

2.2 MT T檢測細胞增殖結(jié)果

MEPE轉(zhuǎn)染細胞和 EGFP空載體轉(zhuǎn)染組細胞鋪96孔板,并分別于 1d、3d、5d、7d用 MTT法測細胞增殖。從統(tǒng)計結(jié)果可知轉(zhuǎn)染 MEPE的293T細胞其增殖指數(shù)是轉(zhuǎn)染EGFP空載體組細胞增殖指數(shù)的1.30倍。見表 1,圖2。

圖2 M TT法檢測293T轉(zhuǎn)染 MEPE及 EGFP細胞增殖結(jié)果

表1 MTT法檢測 MEPE及 EGFP空載體轉(zhuǎn)染293T細胞增殖指數(shù) (±s)

表1 MTT法檢測 MEPE及 EGFP空載體轉(zhuǎn)染293T細胞增殖指數(shù) (±s)

組別 實驗分組(d)1 3 5 7 EGFP 組 0.11± 0.01 0.35± 0.13 0.65± 0.03 1.24± 0.12 M EPE組 0.39± 0.06 0.67± 0.08 1.62± 0.18 2.21± 0.28 t 6.17 3.59 7.29 4.53 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.3 RT-PCR檢測增殖與遷移相關(guān)因子表達情況

p53基因高表達細胞可表現(xiàn)出黏附、增殖、遷移侵襲等方面的生物學行為,實驗通過實時熒光定量 PCR,檢測轉(zhuǎn)染MEPE蛋白與轉(zhuǎn)染空載體細胞中三種基因的表達,從 PCR產(chǎn)物電泳圖及實時熒光擴增曲線兩方面比較三種基因在兩種細胞中的不同表達。

圖3 轉(zhuǎn)染 M EPE及空載體細胞中 p53基因表達

1.DL 500DN Amarker;2.轉(zhuǎn)染 M EPE細胞中 p53表達;3.轉(zhuǎn)染空載體細胞中 p53表達;4.DL 500DN Amarker;5.轉(zhuǎn)染 MEPE細胞中GAPDH表達;6.轉(zhuǎn)染空載體細胞中 GAPDH表達。

3 討論

MEPE是小型 N端連接整合素家族蛋白成員,近幾年來,越來越多的報道顯示 SIBL IN G家族成員與腫瘤發(fā)展的各個階段包括增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成相關(guān)。Lee JL等[4]人發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白(OPN)與細胞表面受體蛋白 CD44相結(jié)合,可以使結(jié)腸癌 HT29細胞加速增殖并提高轉(zhuǎn)移潛能。Sharp JA等[5]人發(fā)現(xiàn)骨唾液蛋白(BSP)可以在體外促進乳腺癌MDA-MB231細胞增殖 ,轉(zhuǎn)染 IBSP基因的乳腺癌細胞注射裸鼠后腫瘤形成速度加快。Khodavirdi AC等[6]人在兩株前列腺癌細胞中提高OPN蛋白的表達水平,發(fā)現(xiàn)OPN有增加細胞侵襲的能力,在小鼠成瘤模型中觀察到高表達OPN的前列腺癌細胞侵入血管的能力增強。對大量的實驗結(jié)果分析,我們可以發(fā)現(xiàn) SIBLIN G蛋白家族成員在許多腫瘤細胞中高表達,作為可溶性分泌性蛋白因子主要分布在細胞基質(zhì)中,通過與細胞表面受體蛋白 CD44、整合素受體、金屬蛋白酶相互作用參與調(diào)節(jié)細胞信號傳導,在腫瘤細胞的黏附性、趨化性、抗凋亡、侵襲、遷移、不依賴支持物生長等惡性生物學特性中具有重要作用,并與腫瘤轉(zhuǎn)移以及預后不良相關(guān)。

在 SBLIN G家族中對于 MEPE在腫瘤發(fā)生發(fā)展中所起到的作用研究較少,與其他家族成員在結(jié)構(gòu)上高度同源的MEPE是否也對腫瘤細胞的增殖侵襲有影響,需要進一步實驗驗證。近年來研究表明,許多腫瘤在發(fā)展過程中伴有MEPE蛋白的高表達,而且發(fā)現(xiàn)這些高表達 MEPE蛋白的腫瘤同時也表現(xiàn)出高的轉(zhuǎn)移傾向,且其抗電離輻射等抵抗DN A損傷誘導能力與 MEPE蛋白的表達量呈正相關(guān)。本實驗結(jié)果證明提高 MEPE蛋白表達水平可影響細胞增殖等生物學特性,并進一步證實其作用機制是通過 P53蛋白信號通路實現(xiàn)的。因此臨床檢測 MEPE表達可對惡性腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移做出預測,為惡性腫瘤基因治療奠定基礎(chǔ)。而且檢測MEPE的表達水平還可監(jiān)測腫瘤治療的預后,為腫瘤基因基因治療提供新的靶點。雖然目前基因治療尚未臨床普及,但其具有良好的潛在應用前景,在人類攻克癌癥,提高腫瘤患者生存率及生活質(zhì)量上有望發(fā)揮重要作用。

[1]Rowe PS,De Zoysa PA,Dong R,et al.MEPE,a new gene expressed in bone marrow and tumors causing osteomalacia[J].G enomics,2000,67(1):54-68

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[3]Fisher LW,Fedarko N S.Six genes expressed in bones and teeth encode the current members of the SIBLIN G family of proteins[J].Connect Tissue Res,2009,44(Suppl 1):33-40

[4]Lee J L.Osteopontin promotes integrin activation through outside-in and inside-out mechanisms:OPN-CD44V interaction enhances survival in gastrointestinal cancer cells[J].Cancer Res,2007,67:2089-2097

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[6]Sharp J A,Waltham M,Williams ED,et al.Transfection of MDA-MB- 231 human breast carcinoma cells with bone sialoprotein(BSP)stimulates migration and invasion in vitro and growth of primary and secondary tumors in nude mice[J].Clin Exp Metastasis,2004,21:19-29