褚春民,陳 放,張洪泉,卜 平

(1.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院診斷學(xué)教研室;2.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)藥研究所;3.揚(yáng)州大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所,江蘇揚(yáng)州,225001)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種常見全身性自身免疫疾病,以關(guān)節(jié)及其周圍組織炎癥為特征,以慢性、多發(fā)性、對(duì)稱性關(guān)節(jié)腫痛為主要表現(xiàn)。發(fā)病機(jī)制尚未明確,因而缺乏真正有效且副作用小的治療藥物[1]。穿山龍又名穿龍薯蕷、穿地龍、雞骨頭、狗山藥,為薯蕷科多年生藤本植物穿山龍薯蕷的根莖,主要產(chǎn)于中國(guó)遼寧、吉林、黑龍江、河北等地區(qū)。中醫(yī)認(rèn)為其具有舒筋活血,止咳化痰,祛風(fēng)止痛,可用于腰腿疼痛、筋骨麻木、跌打損傷、閃腰、咳嗽喘息、氣管炎等,均有明確療效[2]。穿山龍含多種生化成分,如薯蕷皂苷(dioscin),纖細(xì)薯蕷皂甙(gracillin),穗菝葜甾甙(asperin),25-D-螺甾-3,5-二烯(25-D-spirosta-3,5-diene)及對(duì)羥基芐基酒石酸(piscidic acid)等,其中薯蕷皂苷含量最多,藥用價(jià)值最大。作者從免疫功能方面探討薯蕷皂苷對(duì)膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠的預(yù)防和治療作用,為其進(jìn)一步臨床應(yīng)用尋找實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年雄性SD大鼠60只,由揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供,許可證號(hào)SYXK(蘇)2002-0045,體質(zhì)量(180±20)g。動(dòng)物保護(hù)、使用和所有程序都按照動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求操作。大鼠于實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,自然光照,控制室溫20～22℃,并給予充足的標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用水。

1.2 藥物與試劑

薯蕷皂苷,單體,分子式C45H72O16,由浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥炮制中心提供,純度95%;不溶于水,可溶于0.5%CMC-Na;吲哚美辛片(河南太龍藥業(yè)股份有限公司,臨用前用0.5%CMCNa配成8 mg/kg);雞Ⅱ型膠原(CCII)、弗氏完全佐劑(FCA)(美國(guó) Sigma公司);RPMI-1640(美國(guó)Gibco公司);D-Hanks液,參照文獻(xiàn)自行配制;IL-1、TNF-αELISA檢測(cè)試劑盒購買于武漢博士德生物工程有限公司;刀豆蛋白A、MT T:美國(guó)Sigma公司。

1.3 儀器設(shè)備

YLS-7B足趾容積測(cè)量?jī)x,淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司;751型紫外分光光度計(jì),上海成光儀器有限公司;THERMO Multiskan FC全自動(dòng)酶標(biāo)儀,北京平利洋公司;TGL19臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),諾基儀器公司產(chǎn)品;LRH-250A生化培養(yǎng)箱,廣東省醫(yī)療器械廠;BP110S型電子天平:德國(guó)Sartorins產(chǎn)品。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 CIA模型大鼠的造模方法與實(shí)驗(yàn)方案

2.1.1 大鼠CIA模型的制備:制備CCII乳劑(終濃度為1 g/L)。用容積法測(cè)定正常大鼠雙后肢足初始容積(mL)后,將該乳劑于每只大鼠的右后足趾皮內(nèi)注射0.1 mL致敏。第7天于尾根部近1/3處皮內(nèi)注射該乳劑0.1 mL作為激發(fā)注射。正常對(duì)照組大鼠注射同等體積的生理鹽水[3]。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方案:取健康雄性SD大鼠,隨機(jī)分為6組,設(shè)置正常對(duì)照組、模型組、陽性對(duì)照組、薯蕷皂苷(30、60、120 mg/kg)組。從第12天開始CIA大鼠灌胃給藥,連續(xù)14 d,陽性對(duì)照組給予吲哚美辛(IND,8 mg/kg),正常對(duì)照組和CIA模型組給予0.5%CMC-Na。并分別于造模后第12、18、24、30天用足容積測(cè)量?jī)x測(cè)量大鼠非致炎足(左足)的容積,求出致炎前后足容積的差值即足腫脹度(△mL=致炎后容積-致炎前容積),以此觀察Dioscin對(duì)CIA大鼠繼發(fā)性關(guān)節(jié)腫脹的影響。

2.2 免疫臟器稱重

造模后第30天處死大鼠,打開胸腔和腹腔,剝離胸腺和脾臟后立即用電子分析天平稱重,各鼠胸腺、脾臟重量與其體重比值即為該鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。以此觀察Dioscin對(duì)CIA大鼠免疫器官的影響。

2.3 脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)檢測(cè)

造模后第30天處死大鼠,參照文獻(xiàn)[4]制備大鼠脾細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109/L。于96孔培養(yǎng)板上每孔加入脾細(xì)胞懸液100 μ L,再加入 100 μ L 的含 ConA(終質(zhì)量濃度 5 μ g/mL)的RPM I-1640培養(yǎng)液,3個(gè)復(fù)孔,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h,終止培養(yǎng)前4 h每孔加入5 g/L MTT 10 μ L振蕩后繼續(xù)培養(yǎng),離心棄去上清,加酸化異丙醇 120 μ L,于酶標(biāo)儀 570 nm處測(cè)D值,結(jié)果取3個(gè)復(fù)孔D的均值。

2.4 腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的檢測(cè)[5]

大鼠處死后,常規(guī)制備大鼠腹腔巨噬細(xì)胞,用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×109/L,采用中性紅法測(cè)定大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力,結(jié)果以酶標(biāo)儀570 nm處D均值表示。

2.5 巨噬細(xì)胞 IL-1、TNF-a水平的檢測(cè)

同2.4項(xiàng)制備巨噬細(xì)胞,24孔培養(yǎng)板,每孔加入巨噬細(xì)胞懸液1 mL,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h,棄去培養(yǎng)液,D-Hanks洗滌 3次,獲單層巨噬細(xì)胞,再加入1 mL含ConA(終質(zhì)量濃度 5 μ g·mL-1)的 RPM I-1640 培養(yǎng)液 ,培養(yǎng) 48 h離心收集上清液,按ELISA檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)IL-1和TNF-a的含量。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 薯蕷皂苷對(duì)CIA大鼠繼發(fā)性關(guān)節(jié)腫脹的影響

與正常對(duì)照組比較,CIA模型組致炎后第12、18、24、30天繼發(fā)側(cè)足腫脹度與正常組比較明顯增加(P<0.01);薯蕷皂苷(60、120 mg/kg)及IND用藥第24、30天可減輕CIA大鼠的足腫脹度,與模型組相比有明顯差異(P<0.01);薯蕷皂苷(30 mg/kg)用藥30 d可減輕CIA大鼠的足腫脹度,有顯著性差異(P<0.01),(表1)。

表1 薯蕷皂苷治療對(duì)CIA大鼠足爪容積的影響(n=10)

3.2 薯蕷皂苷對(duì)CIA大鼠臟器指數(shù)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CIA大鼠胸腺、脾臟指數(shù)與正常對(duì)照組相比明顯增大,差別有顯著意義(P<0.01,P<0.05)。Dioscin各劑量組與IND陽性組均能降低CIA大鼠胸腺指數(shù),差異顯著(P<0.01,P<0.05)。但Dioscin各劑量組脾臟指數(shù)與模型組相比,差別無顯著意義(P>0.05),見表2。

表2 薯蕷皂苷治療對(duì)CIA大鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響(n=10)

3.3 薯蕷皂苷對(duì)CIA大鼠淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和

腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響

與正常對(duì)照組比較,CIA大鼠淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力明顯降低,有顯著性差異(P<0.05);薯蕷皂苷(60、120 mg/kg)及IND陽性組均能提高CIA大鼠淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力,差異顯著(P<0.05)。薯蕷皂苷(30 mg/kg)與CIA模型組比較無顯著性差異(P>0.05),見表3。

3.4 血清 IL-1、TNF-α的檢測(cè)

無菌摘取眼球取血,分離血清,0.45μm微孔濾膜過濾除菌。-20℃保存待測(cè)細(xì)胞因子。IL-1、TNF-α含量測(cè)定采用ABC-ELISA法,按說明書要求操作。結(jié)果顯示:CIA大鼠血清中IL-1和TNF-α水平明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)。薯蕷皂苷各劑量組及IND陽性組可劑量依賴性降低CIA大鼠 IL-1和 TNF-α的含量,使過度分泌IL-1和TNF-α的功能得到不同程度的恢復(fù)(P<0.05或P<0.01),見表4。

表3 薯蕷皂苷對(duì)CIA大鼠淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響(n=10)

表4 薯蕷皂苷對(duì)C IA大鼠血清IL-1、TNF-α含量的影響(n=10)

4 討 論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎又稱類風(fēng)濕,目前公認(rèn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種自身免疫性疾病。可能與內(nèi)分泌、營(yíng)養(yǎng)、地理、職業(yè)、心理和社會(huì)環(huán)境的差異、細(xì)菌和病毒感染及遺傳因素等方面有關(guān)系,以慢性、對(duì)稱性、多滑膜關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)外病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn),屬于自身免疫炎性疾病。該病好發(fā)于手、腕、足等小關(guān)節(jié),反復(fù)發(fā)作,呈對(duì)稱分布。早期有關(guān)節(jié)紅、腫、熱、痛和功能障礙,晚期關(guān)節(jié)可出現(xiàn)不同程度的僵硬畸形,并伴有骨和骨骼肌的萎縮,極易致殘。從病理改變的角度來看,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種主要累及關(guān)節(jié)滑膜(以后可波及關(guān)節(jié)軟骨、骨組織、關(guān)節(jié)韌帶和肌腱),其次為漿膜、心、肺及眼等結(jié)締組織的廣泛性炎癥性疾病。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的全身性表現(xiàn)除關(guān)節(jié)病變外,還有發(fā)熱、疲乏無力、皮下結(jié)節(jié)、胸膜炎、動(dòng)脈炎、周圍神經(jīng)病變等。廣義的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎除關(guān)節(jié)部位的炎癥病變外,還包括全身的廣泛性病變。目前藥物治療主要包括非甾體抗炎藥、慢作用抗風(fēng)濕藥、免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素、生物制劑及植物藥等。主要作用體現(xiàn)在抑制自身免疫反應(yīng),減緩病情的發(fā)展。但各種西藥治療只能止痛,不能治痛,長(zhǎng)期服用易產(chǎn)生依賴性和毒副作用,尤其是這些方法治療方法對(duì)人體的腎臟影響太大。免疫抑制劑雖然有明確的療效,但由于其具有較大的毒副作用,臨床應(yīng)用受到一定的限制。所以尋找治療效果明確、毒副作用小的傳統(tǒng)中藥,如穿山龍及其提取物薯蕷皂苷等,并對(duì)其進(jìn)行深層次的研究和探索,具有廣闊的應(yīng)用前景和效益。

自Trentham等[6]首次用小牛二型膠原(CII)誘導(dǎo)動(dòng)物關(guān)節(jié)炎成功以來,由于該關(guān)節(jié)炎病理過程與RA相似,有關(guān)CII免疫特性的研究已經(jīng)非常細(xì)致和深入,是篩選和研究治療RA藥物的理想模型之一。本研究用異源性CCII造模,大鼠在致敏后等14 d足出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹,第22天腫脹達(dá)高峰,并伴有前肢關(guān)節(jié)明顯紅腫、繼發(fā)性的多發(fā)性末端關(guān)節(jié)炎,耳部出現(xiàn)紅斑、尾部有串珠狀結(jié)節(jié)形成,這些與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[7]。推測(cè)原因可能與抗原抗體復(fù)合物的參與、補(bǔ)體活化及遲發(fā)型超敏反應(yīng)等因素有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,從第24天起薯蕷皂苷組可明顯減輕關(guān)節(jié)炎癥程度,促進(jìn)CIA大鼠胸腺指數(shù)的恢復(fù),抑制其滑膜增生和軟骨破壞,表明薯蕷皂苷對(duì)CIA大鼠具有治療作用,其對(duì)關(guān)節(jié)炎的治療作用可能與上述機(jī)制有關(guān)。

胸腺(thymus)為機(jī)體的重要淋巴器官。其功能與免疫緊密相關(guān),分泌胸腺激素及激素類物質(zhì),具內(nèi)分泌機(jī)能的器官。對(duì) T淋巴細(xì)胞的發(fā)育成熟具有極為重要的意義。其分泌的胸腺素能使免疫缺陷病人的T細(xì)胞機(jī)能得到恢復(fù),可誘導(dǎo)無胸腺及去胸腺小鼠的T細(xì)胞機(jī)能,脾臟是機(jī)體最大的免疫器官,占全身淋巴組織總量的25%,含有大量的T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,是機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的中心。測(cè)定ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞增殖的強(qiáng)弱,能反應(yīng)藥物對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的影響[8],脾臟切除導(dǎo)致細(xì)胞免疫和體液免疫功能的紊亂,影響類風(fēng)濕的發(fā)生和發(fā)展。胸腺和脾臟相對(duì)質(zhì)量的變化已被廣泛用于評(píng)價(jià)機(jī)體的整體免疫狀態(tài)。藥物對(duì)動(dòng)物胸腺、脾臟質(zhì)量的影響,亦可作為免疫藥理機(jī)制的指標(biāo)之一[9]。本研究發(fā)現(xiàn),薯蕷皂苷對(duì)胸腺質(zhì)量有明顯降低作用,但對(duì)脾臟質(zhì)量作用較小,表明薯蕷皂苷對(duì)中樞免疫器官有作用,對(duì)外周免疫器官無明顯影響,可能通過減輕胸腺質(zhì)量來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

巨噬細(xì)胞是機(jī)體的重要屏障,參與非特異性防衛(wèi)(先天性免疫)和特異性防衛(wèi)(細(xì)胞免疫)。它們的主要功能是以固定細(xì)胞或游離細(xì)胞的形式對(duì)細(xì)胞殘片及病原體進(jìn)行噬菌作用(即吞噬以及消化),并激活淋巴細(xì)胞或其他免疫細(xì)胞,令其對(duì)病原體作出反應(yīng)。還可分泌多種生物活性物質(zhì)以及多種酶類物質(zhì),其中生物活性物質(zhì)又稱巨噬細(xì)胞源性生物因子,包括多肽轉(zhuǎn)換生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子以及一氧化氮等;酶類物質(zhì)主要包括膠原酶、彈性蛋白酶、纖溶酶原激活劑等;這些生物活性物質(zhì)直接引導(dǎo)著機(jī)體修復(fù)的整個(gè)進(jìn)程。在機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞和體液免疫之前發(fā)揮防御作用。IL-1由單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和其他類型細(xì)胞在應(yīng)答感染時(shí)產(chǎn)生的細(xì)胞因子。有 IL-1α和 IL-1β2種類型,都與免疫球蛋白超家族的同一受體結(jié)合。能刺激集落刺激因子、血小板生長(zhǎng)因子等細(xì)胞因子的產(chǎn)生和使T細(xì)胞產(chǎn)生白介素-2,在免疫應(yīng)答和組織修復(fù)中起作用,是保障機(jī)體正常免疫功能的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。TNF-a在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病理過程中發(fā)揮著獨(dú)特而復(fù)雜的作用,如在體外可使軟骨和骨發(fā)生退行性變;在滑膜和關(guān)節(jié)軟骨連接處TNF-a與其受體同時(shí)存在;在培養(yǎng)的RA來源的滑膜細(xì)胞(淋巴細(xì)胞,巨噬細(xì)胞,樹突狀細(xì)胞,B細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞中調(diào)節(jié)IL-1產(chǎn)生的中樞作用[10],TNF-a能誘導(dǎo)其他細(xì)胞產(chǎn)生更加廣泛的致炎物質(zhì),很明顯它是一種炎癥反應(yīng)成分。TNF-a還可與IL-1協(xié)同誘導(dǎo)RA患者滑膜巨噬細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞[11]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CIA大鼠血清IL-1和TNF-a的水平明顯高于正常組,薯蕷皂苷體內(nèi)給藥可劑量依賴性降低CIA大鼠胸腺指數(shù),提高淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、增強(qiáng)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能,抑制IL-1和TNF-a的生成。提示薯蕷皂苷發(fā)揮治療作用可能與其調(diào)節(jié)免疫功能、抑制巨噬細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子有關(guān)。

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