孫愛萍 程曉曙

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006)

血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的異常增殖是包括動(dòng)脈粥樣硬化在內(nèi)的血管增殖性疾病的共同病理基礎(chǔ)〔1〕。動(dòng)脈粥樣硬化有著較高的致病率和致死率，是一類嚴(yán)重威脅人類健康的疾病〔2〕。動(dòng)脈粥樣硬化的病理變化包括脂質(zhì)聚集、單核-巨噬細(xì)胞的侵入、泡沫細(xì)胞形成、炎癥及 VSMC增生等〔3〕。其中，VSMC的過度增殖被認(rèn)為是促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的一個(gè)關(guān)鍵因素。國外有研究表明，Hedgehog(HH)信號通路的激活可促進(jìn)創(chuàng)傷后微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和抑制其凋亡，有利于損傷毛細(xì)血管的修復(fù)〔4〕。國內(nèi)研究顯示，SHH通路啟動(dòng)因子重組SHH可促進(jìn)海水浸泡血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和抑制其凋亡，證實(shí)SHH信號通路通過作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞而促進(jìn)毛細(xì)血管的修復(fù)〔5〕。本研究通過體外培養(yǎng)VSMC，并采用SHH信號通路特異抑制劑環(huán)巴胺(Cyclopamine)進(jìn)行干預(yù)，研究SHH信號通路在VSMC增殖中的作用，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人臍動(dòng)脈VSMC株，由中國科學(xué)院細(xì)胞中心提供;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清，由美國Hyclone公司提供;Cyclopamine，由美國Biomol公司提供;二甲基亞砜(DMSO)，由美國Sigma公司提供;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、碘化丙啶(PI)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供。ELITEESP型流式細(xì)胞儀，由美國Coulter公司提供;Multicycle分析軟件，由美國Phoenix公司提供。

1.2 VSMC的培養(yǎng) 將VSMC接種在含10%胎牛血清、雙抗(100 U/ml青霉素和100 g/ml鏈霉素)的高糖DMEM培養(yǎng)液中，然后于37℃、飽和空氣濕度和5%CO2條件下在孵箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)0.25%胰酶+0.2%乙二胺四乙酸(EDTA)消化傳代，3 d傳1代，實(shí)驗(yàn)用第4～5代細(xì)胞。

1.3 MTT方法測定細(xì)胞增殖 傳代細(xì)胞融合生長至80%左右時(shí)經(jīng)消化后調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至5×104/ml，接種于96孔板，每孔加200μl懸液。各培養(yǎng)孔加入Cyclopamine，終濃度分別為0.625、1.25和2.5μmol/L。以酒精(Cyclopamine的溶媒)作為空白對照，終濃度為0.1%。上述細(xì)胞分別培養(yǎng)12、24 h和48 h時(shí)，每孔加入5 mg/ml MTT 20μl。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入DMSO顯色。最后用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度(A值)。每孔設(shè)定5個(gè)復(fù)孔，取其均值作為最終測量值。細(xì)胞增殖抑制率(%)=1-δA 值實(shí)驗(yàn)孔/× δA 值對照孔100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡 按MTT實(shí)驗(yàn)操作，各培養(yǎng)孔加入Cyclopamine，終濃度分別為1.25和2.5μmol/L，培養(yǎng)24 h和48 h。消化收集各組細(xì)胞，并用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，用4℃無水乙醇固定30 min，離心，染色30 min后采用流式細(xì)胞檢測儀檢測細(xì)胞周期，檢測結(jié)果經(jīng)Multicycle軟件分析。凋亡指數(shù)(AI)=亞二倍峰細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%，增殖指數(shù)(PI)=(S期 +G2/M期)(G0/G1期 +S期 +G2/M期)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以x±s表示。

2 結(jié)果

2.1 Cyclopamine對增殖指數(shù)和AI的影響 在培養(yǎng)液中加入不同濃度Cyclopamine后，VSMCPI降低，AI升高。見表1。

表1 Cyclopamine對增殖指數(shù)和AI的影響(x±s)

2.2 Cyclopamine對細(xì)胞增殖的影響 在培養(yǎng)液中加入不同濃度Cyclopamine后，平滑肌細(xì)胞的增殖均受到抑制，并且抑制作用呈濃度及時(shí)間依賴性。見表2。

2.3 Cyclopamine對細(xì)胞周期的影響 在培養(yǎng)液中加入不同濃度Cyclopamine后，VSMC中處于G0/G1期的比例升高，而處于S期和G2/M期的比例降低。見表3。

表2 Cyclopamine對細(xì)胞增殖的影響(x±s)

3 討論

目前對動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病原因尚未完全確定，可能與年齡、性別、血脂異常、高血壓、吸煙、糖尿病、肥胖、感染等因素有關(guān)〔6〕。近年來的觀點(diǎn)認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病，VSMC過度增殖被認(rèn)為是促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的一個(gè)關(guān)鍵因素〔7，8〕。闡明血管平滑肌在病理性刺激中的增殖機(jī)制，對減緩動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程，預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展可能起到積極的作用。

HH基因編碼一系列分泌型信號蛋白，在胚胎的發(fā)育過程中起著調(diào)控細(xì)胞增殖及組織分化的作用，在成熟器官中HH信號通路處于失活狀態(tài)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，HH信號通路參與多種損傷后的組織修復(fù)過程，包括四肢、血管、前列腺、神經(jīng)、膽管、肺以及骨骼〔4〕。但是，HH信號在不同組織中所起的作用是不一致的，認(rèn)為HH信號的調(diào)節(jié)作用可能由于種屬、體內(nèi)、體外以及環(huán)境的不同而有所不同〔9〕。此外，研究顯示，HH信號系統(tǒng)與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，在器官形態(tài)發(fā)育、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖中起重要的作用〔10〕。SHH信號通路在人類根據(jù)配體的不同分為3個(gè)亞型，即SHH信號通路、Indian hedgehog(IHH)信號通路及Desert hedgehog(DHH)信號通路〔11〕。該信號途徑是由SHH、2個(gè)跨膜受體Patched(Ptc)和Smoothed(Smo)組成的受體復(fù)合物、蛋白激酶A以及下游轉(zhuǎn)錄因子Gli家族(Glil、Gli2、Gli3)等組成，在進(jìn)化上高度保守〔12〕。SHH信號通路在胚胎發(fā)育中的細(xì)胞生長分化、組織器官形成及成體干細(xì)胞的維持等方面具有重要的作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，SHH信號通路參與調(diào)控VSMC和內(nèi)皮細(xì)胞的分化，誘導(dǎo)肺血管形成，從而促進(jìn)肺的發(fā)育成熟和器官形成〔13〕。此外，SHH通路啟動(dòng)因子重組SHH可促進(jìn)海水浸泡血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和抑制其凋亡，證實(shí)SHH信號通路通過作用血管內(nèi)皮細(xì)胞而促進(jìn)毛細(xì)血管的修復(fù)〔14〕。

Cyclopamine是從藜蘆屬植物內(nèi)分離得到的一種異甾體類生物堿，通過對抗SHH信號通路中Smoothed(Smo)蛋白而特異性抑制 SHH信號通路〔15〕。MTT結(jié)果顯示，培養(yǎng)液中加入0.625、1.25和2.5μmol/L Cyclopamine后血管平滑肌增殖受到明顯抑制，Cyclopamine對血管平滑肌增殖的抑制作用呈濃度及時(shí)間依賴性。因此，SHH信號通路在血管平滑肌增殖過程中起著一定作用。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，在培養(yǎng)液中加入1.25和2.5μmol/L Cyclopamine后，VSMC中處于G0/G1期的比例升高，而處于S期和G2/M期的比例降低，從而導(dǎo)致PI降低和AI升高。因此，SHH信號通路在VSMC增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用，但是其確切的機(jī)制尚需作進(jìn)一步研究。

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