張 晶 梁小亮 黃連江 袁玉濤 孫紅琰

(廈門市第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建 廈門 361021)

理想的腫瘤治療制劑應(yīng)能選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞終末分化，使其徹底失去潛在的生長能力，且對正常細(xì)胞無毒性作用。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，屬 PDGF家族〔1〕，其中 VEGF121方式的不同可能特異的與VEGFR-2結(jié)合〔2，3〕，而惡性腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)VEGFR-2;DFF40又稱DNA斷裂因子40(DFF40)從小鼠淋巴細(xì)胞胞質(zhì)中分離得到的Caspase依賴的脫氧核糖核酸酶(CAD)，二者合稱為CAD/DF40，它被認(rèn)為可能是DNA降解過程中的主要核酸內(nèi)切酶〔4〕。本研究旨在探討DFF40與VEGF121結(jié)合對新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡作用。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與菌株 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、BL21(DE3)均購自博大泰克公司;PET28a菌株由本室保存;PGEM-T載體購自Promega公司。

1.2 試劑、細(xì)胞株 Trizol試劑購自Invitrogen公司;AMV RT、PGEM-T載體、PCR產(chǎn)物純化試劑盒及Random引物購自Premega公司;dNTP購自上海生工;RNAsin Ribonuclease抑制劑、Tag DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、Nde1、Not1酶均購自TaKaRa公司;質(zhì)粒小量提取試劑盒購自Sigma公司，DMEM購自Gibco公司;MTT試劑購自美國Amresco公司;DMSO購自Sigma公司;HL-60細(xì)胞及HUVEC細(xì)胞購自協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)所細(xì)胞中心，肝癌細(xì)胞取自武警總醫(yī)院。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 分別克隆VEGF121基因、DFF40基因，并相連接，VEGF121-DFF40與PGEM-T載體連接，4℃過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，挑菌，鑒定，陽性的克隆送測序。選測序正確的克隆提取質(zhì)粒，進(jìn)行Nde1、Not1雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，連接 PET28a載體，4℃過夜，轉(zhuǎn)化DH5α，挑菌鑒定，將陽性的克隆放大培養(yǎng)提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。

1.3.2 誘導(dǎo)表達(dá) 將轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)的菌進(jìn)行放大培養(yǎng)，至 OD值為0.6左右時(shí)，加入 IPTG至終濃度為1 mmol/L，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，做聚丙烯酰胺凝膠電泳。按不同的IPTG濃度及不同的誘導(dǎo)時(shí)間篩選最佳表達(dá)參數(shù)。大量誘導(dǎo)表達(dá)，離心收菌，用含10 mmol/L咪唑的裂解液進(jìn)行懸菌，加入去氧膽酸鈉及溶菌酶、PMSF，混勻放置30 min，再冰浴下超聲至液體不再黏稠，4℃離心，分別收集上清和沉淀，將沉淀用洗液懸起來，分別取上清和沉淀進(jìn)行電泳，進(jìn)行目的蛋白表達(dá)形式的分析，證實(shí)主要以包涵體形式表達(dá)。

1.3.3 純化 洗包涵體用1M尿素洗3次，每次洗完進(jìn)行超聲，用6M鹽酸胍溶解包涵體，用含50 mmol/L Tris、0.8 mol/L L-arg、2 mmol/L GSH 、0.4 mmol/L GSSG、20 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA的復(fù)性液進(jìn)行稀釋復(fù)性，用含10 mmol/L咪唑的平衡液進(jìn)行透析，過親和層析柱，得到純化的蛋白。進(jìn)行Western印跡分析，方法按常。

1.3.4 體外實(shí)驗(yàn) 用M199培養(yǎng)液培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，HUVEC細(xì)胞，取對數(shù)生長期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞濃度為2×104/ml。將兩種細(xì)胞加入96孔培養(yǎng)板中，每孔50μl，實(shí)驗(yàn)孔加入蛋白終濃度分別為100、75、50、25 μg/ml，對照組加入 PBS，各設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)。每孔加入5μg/ml的MTT溶液20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 100μl，震蕩搖勻10 min，使結(jié)晶物充分溶解。利用酶標(biāo)儀在595 nm波長處測定各孔的吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率(IR)，并繪制生長曲線。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件，不同濃度蛋白對腫瘤的影響采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)以x±s表示。

2 結(jié)果

2.1 基因克隆 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，分別在500 bp左右及700 bp左右出現(xiàn)條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，DNA序列分析結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的序列均一致。如圖1。

2.2 重組質(zhì)粒 取測序正確的雙酶切產(chǎn)物與表達(dá)載體PET28a(+)連接獲得的質(zhì)粒p-VD，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行PCR鑒定，得到了陽性克隆提取質(zhì)粒用Nde1及Not1雙酶切可得1 200 bp片段，提示構(gòu)建成功。見圖2。

2.3 融合蛋白在大腸桿菌中表達(dá) 將轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)的菌落挑取斑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，加入 IPTG濃度為1 mmol/L，誘導(dǎo)4 h，如圖3，可看到明顯表達(dá)帶。

2.4 純化及Western印跡結(jié)果 用Ni-NTA柱進(jìn)行純化，得到了非常純的目的蛋白見圖4，將表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE后電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，作Western印跡，結(jié)果得到在44 000 D附近的條帶，與結(jié)果相符，見圖5。

2.5 MTT法細(xì)胞毒性測定結(jié)果 見表1。融合蛋白對兩種細(xì)胞的直接作用與PBS組均有顯著性差異(P＜0.01)，提示此融合蛋白對兩種細(xì)胞均有直接殺傷作用。當(dāng)?shù)鞍诐舛仁?5μg/ml時(shí)對肝癌細(xì)胞的直接作用與PBS組無顯著性差異(P＞0.05)，其余各組均有顯著性差異，說明從50μg/ml起對腫瘤細(xì)胞有直接作用，抑制率約為5%，蛋白濃度是100μg/ml時(shí)抑制率為6.5%;而HUVEC組則每個(gè)蛋白濃度均與PBS組有顯著性差異(P＜0.01)，其抑制率為42%，而當(dāng)?shù)鞍诐舛仁?00μg/ml時(shí)抑制率為71%，明顯高于肝癌細(xì)胞組。

表1 不同濃度融合蛋白體外直接細(xì)胞毒作用OD(x±s)

圖1 DFF40及VEGF基因PCR擴(kuò)增

圖2 p-VD酶切質(zhì)粒電泳圖 圖3 融合蛋白的表達(dá)

圖4 純化的融合蛋白

圖5 融合蛋白的Western印跡

3 討論

目前，惡性腫瘤仍然是威脅人類生命的重大隱患之一，我們期待一種特效抗腫瘤藥物的出現(xiàn)。血管內(nèi)皮生長因子作為內(nèi)皮細(xì)胞特異的有絲分裂原〔5，6〕，在血管發(fā)生和形成過程中起重要的調(diào)節(jié)作用，VEGF在腫瘤的血管形成和維持中也起著重要作用，與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、預(yù)后關(guān)系密切，正因?yàn)槿绱?，越來越多的研究將VEGF及其受體作為靶點(diǎn)用于腫瘤的治療。

本研究利用VEGF與DFF40結(jié)合的這種特點(diǎn)，成功克隆了目的基因并在大腸桿菌中表達(dá)，摸索出一套純化蛋白的方法，并證明其在體外對肝癌細(xì)胞及人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞均有殺傷作用，故它作為一種融合蛋白很有可能成為殺傷惡性腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的重要物質(zhì)，為今后大量生產(chǎn)、研究其生物學(xué)活性以及將來基因工程藥物的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 Neafeld G，Tessler S，Gitag-Goren H，et al.Vascular endothelial growth faetor and its receptors〔J〕.Prog Growth Fact Res，1994;5(12):89-95.

2 Folkman J，Shing Y.Angiogenesis〔J〕.J Biol Chem，1992;267(4):10931-45.

3 Brooks PC.Cell adhension molecules in angiogenesis〔J〕.Cancer Metastasis Rev，1996;15(6):187-92.

4 Harper SJ，Bates DO.VEGF-A splicing:the key to anti-angiogenictherapeutics〔J〕?Nat Rev Cancer，2008;8:880-7.

5 Konishi S，Ishiguro H，Shibata Y，et al.Decreased expression of DFF45/ICAD is correlated with a poor prognosis in patients with esophageal carcinoma〔J〕.Cancer，2002;95(12):2473-8.

6 Widlak P，Lanuszewska J，Cary RB，et al.Subunit structures and stoichiometries of human DNA fragmentation factor proteins before and after induction of apoptosis〔J〕.JBiol Chem，2003;278(29):26915-22.