姜國良 于 曉 徐 愷 劉 云

(中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003)

目前，人類衰老方面的研究，多采用建立衰老動物模型的方法。衰老動物模型分為自發(fā)性衰老動物模型和實驗性衰老動物模型。實驗性與自發(fā)性相比可控性強(qiáng)，易于回溯，縮短建模時間降低建模成本，優(yōu)化實驗流程。目前，可以利用3種方法構(gòu)建衰老動物模型，其中 D-半乳糖注射法最常用〔1，2〕。D-半乳糖是一種衰老誘導(dǎo)劑。它是一種由六個碳和一個醛組成的單糖，歸類為醛糖和己糖。D-半乳糖誘導(dǎo)建立衰老動物模型多采取腹腔和皮下注射D-半乳糖兩種方法。但是對兩種注射方法所建立的衰老動物相關(guān)指標(biāo)的差異一直未見報道〔3〕。本實驗分別采用皮下和腹腔注射D-半乳糖兩種方法構(gòu)建衰老動物模型，通過胸腺和脾臟指數(shù)、血液及組織生化指標(biāo)檢測、組織切片觀察討論兩種模型間的差異，為實驗動物模型建立的標(biāo)準(zhǔn)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 D-半乳糖(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，葡萄糖測定試劑盒，C反應(yīng)蛋白(CRP)測定試劑盒，丙二醛(MDA)測定試劑盒，總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測試盒，單胺氧化酶(MAO-B)測試盒，測定試劑盒均購自南京建成科技有限公司，其余配置試劑均為普通市售分析純。

1.2 實驗動物 3月齡雄性Wistar大鼠(SPF級)30只，體重174 g±5.3 g，購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，合格證號:SCXLC魯20080002。動物房溫度(22±2)℃，濕度(60±15)%。自然光照。飼喂大鼠飼料，購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司。

1.3 實驗分組和操作 適應(yīng)1 w后開始實驗。將30只大鼠隨機(jī)分為空白組10只，腹腔注射組10只，皮下注射組10只。利用 D-半乳糖0.125 g·kg－1·d－1連續(xù)腹腔和皮下注射40 d。皮下注射部位均為右后大腿內(nèi)側(cè)。末次給藥后24 h，分別稱量3組老鼠的體重，摘眼球取血，離心取血清。另分別取胸腺，脾臟，腹部皮膚和腦組織。稱取胸腺和脾臟重量，皮膚和腦組織一部分在－20℃低溫保藏，另一部浸泡Bouin固定液固定，準(zhǔn)備進(jìn)一步制作切片。

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 計算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù) 根據(jù)稱量所得的體重，胸腺重量和脾臟重量計算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。

1.4.2 血液及組織生化指標(biāo)測定 血清葡萄糖，CRP，MDA，T-SOD，GSH-Px含量，皮膚羥脯氨酸含量以及腦B型單MAO-B含量測定均按照測試盒說明書進(jìn)行，采用分光光度法。

1.4.3 組織切片制作 選取浸泡改良Bouin固定液固定腦和皮膚組織，制作常規(guī)石蠟切片，切片厚度6μm，HE染色后在Nikon顯微鏡下觀察、拍照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 各組實驗數(shù)據(jù)均用SPSS13.0統(tǒng)計軟件做統(tǒng)計學(xué)處理。所得結(jié)果均以x±s表示，并做單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù) 在胸腺指數(shù)上，皮下注射組、腹腔注射組與空白組相比均顯著下降(P＜0.01)。皮下注射組與腹腔注射組之間無明顯差異，但表現(xiàn)出一定的下降趨勢。在脾指數(shù)上，皮下注射組、腹腔注射組與空白組相比均沒有顯著差異(P＞0.05)。皮下注射組與腹腔注射組之間也沒有顯著差異，僅表現(xiàn)下降趨勢。見表1。

表1 不同注射組大鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)(x ± s，n=10)

2.2 血液生化指標(biāo) 在血糖含量上，三組之間沒有明顯差異(P＞0.05)。CRP含量上，腹腔注射組、皮下注射組與空白組相比均顯著升高(P＜0.01)，皮下注射組與腹腔注射組相比明顯升高(P＜0.05)。在MDA含量上，腹腔注射組、皮下注射組與空白組相比均顯著升高(P＜0.01)，腹腔注射組與皮下注射組相比明顯升高(P＜0.01)。T-SOD和GSH-Px活性上，腹腔注射組、皮下注射組與空白組相比均明顯降低(P＜0.01)，腹腔注射組與皮下注射組相比活性降低更加顯著(P＜0.01)。見表2。

表2 不同注射組大鼠血液生化指標(biāo)(x ± s，n=10)

2.3 組織生化指標(biāo) 在腦MAO-B活性上，皮下注射組、腹腔注射組與空白組相比均顯著升高(P＜0.01)，皮下注射組與腹腔注射組相比無明顯差異，僅表現(xiàn)下降趨勢。在皮膚羥脯氨酸含量上，腹腔注射組和皮下注射組與空白組相比均顯著降低(P＜0.01)，皮下注射組與腹腔注射組相比明顯降低(P＜0.05)。見表3。

表3 不同組大鼠的組織生化指標(biāo)(x ± s，n=10)

2.4 皮膚組織切片 空白組皮膚厚度正常，表皮角質(zhì)層完整，基底層細(xì)胞排列整齊。腹腔注射組表皮厚度明顯變薄，表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變且數(shù)量明顯下降，基底層細(xì)胞少數(shù)出現(xiàn)空泡，整體排列仍較整齊。皮下注射組皮膚厚度進(jìn)一步變薄，表皮有部分缺失，基底層細(xì)胞嗜堿性降低，排列疏松紊亂;真皮彈力纖維增粗，堆積，排列不規(guī)則。見圖1。

2.5 腦組織切片 空白組大腦白質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞體清晰可見，結(jié)構(gòu)正常。腹腔注射組大腦白質(zhì)和皮下注射組大腦白質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞體胞質(zhì)不清晰，樹突和軸突縮短消失。腹腔注射組和皮下注射組間差異不大?？瞻捉M大腦灰質(zhì)內(nèi)神經(jīng)纖維排列緊密，結(jié)構(gòu)正常。腹腔注射組大腦灰質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞腫脹，但數(shù)量仍較多。皮下注射組大腦灰質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元纖維排列疏松，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯減少。見圖2。

圖1 各組皮膚組織切片(HE，×400)

圖2 各組大鼠大腦白質(zhì)與灰質(zhì)病理圖片(HE，×400)

3 討論

D-半乳糖導(dǎo)致機(jī)體衰老的主要機(jī)制是:通過連續(xù)注射使D-半乳糖在機(jī)體細(xì)胞內(nèi)累積。細(xì)胞內(nèi)的醛糖還原酶可以將其還原成無法被細(xì)胞代謝的半乳糖醇。胞內(nèi)堆積的半乳糖醇可以影響細(xì)胞的滲透壓，使細(xì)胞腫脹，進(jìn)而使細(xì)胞功能障礙、代謝紊亂，最終導(dǎo)致機(jī)體衰老〔4〕。本實驗表明，兩種注射方法所建立的衰老大鼠模型在各項血液生化指標(biāo)上均有衰老體現(xiàn)，衰老大鼠模型已經(jīng)建立。

衰老機(jī)體內(nèi)較高含量的還原糖可與蛋白質(zhì)、脂類、核酸等大分子中的游離氨基發(fā)生非酶促糖基化反應(yīng)。其通過加成反應(yīng)產(chǎn)生的早期產(chǎn)物經(jīng)重排、脫水形成帶熒光的棕色化合物，即晚期糖基化終末產(chǎn)物AGEs。AGEs隨年齡增長不斷積累，從而促進(jìn)機(jī)體衰老〔5〕。通過試驗比較，腹腔注射和皮下注射D-半乳糖沒有引起衰老大鼠血糖升高，與以往的實驗結(jié)果一致〔6〕。其原因可能是注射劑量和時間不足〔7〕。

體內(nèi)C反應(yīng)蛋白水平能夠?qū)C(jī)體的健康及衰老狀況起到警示作用〔8〕。實驗結(jié)果顯示，兩種衰老大鼠模型的CRP水平較空白組明顯升高，說明衰老機(jī)體正處于不健康狀態(tài)。這可能與各器官、免疫系統(tǒng)等功能性衰退有關(guān)。皮下注射組的CRP水平較腹腔注射組較高可能是由于皮下注射D-半乳糖延長了D-半乳糖對機(jī)體的作用時間，從而使機(jī)體對非健康狀態(tài)更加敏感。

衰老的自由基學(xué)說認(rèn)為體內(nèi)產(chǎn)生過多的氧自由基會將不飽和脂肪酸氧化成超氧化物，從而形成脂褐素。過多的氧自由基還會破壞細(xì)胞膜，使蛋白質(zhì)和酶變性，從而加速衰老。氧化物含量和抗氧化酶的活性是評價機(jī)體氧化水平的主要指標(biāo)。MDA是自由基與脂質(zhì)中不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)所產(chǎn)生的過氧化脂質(zhì)的分解產(chǎn)物。因此，MDA的含量可以反映過氧化程度，從而反映衰老程度。超氧物歧化酶(SOD)和GSHPx是機(jī)體內(nèi)重要的清除自由基的抗氧化酶，可以作為衰老的直觀指標(biāo)。試驗中，兩種衰老大鼠模型較空白組高的MDA含量，較低的T-SOD和GSH-Px的活性反映了機(jī)體的衰老狀態(tài)。即，自由基的累積和抗氧化酶活性的降低，與以往實驗結(jié)果一致〔9〕。皮下注射組的MDA含量較腹腔注射組高，但腹腔注射組T-SOD和GSH-Px的活性較皮下注射組更低，表現(xiàn)出兩種衰老大鼠模型在自由基代謝上的差異。說明腹腔注射D-半乳糖建立的衰老大鼠模型的自由基代謝水平較皮下注射組差，自由基的累積程度較高。因此，在進(jìn)行自由基代謝相關(guān)領(lǐng)域的研究時，選取腹腔注射D-半乳糖建立衰老大鼠模型可能會取得更加顯著的效果。本文結(jié)果說明注射D-半乳糖可以使免疫系統(tǒng)功能下降，但是在兩種衰老大鼠模型間差異不大。這個結(jié)果與徐智等〔10〕的研究結(jié)果一致。

腦MAO-B在衰老機(jī)體內(nèi)的累積可以導(dǎo)致兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)的減少，使大腦的反應(yīng)和思維活動遲緩，是衰老的重要指標(biāo)。實驗結(jié)果顯示腹腔注射組，皮下注射組MAO-B活性與空白組相比明顯升高，而腹腔注射組與皮下注射組相比略有升高。腦組織切片的結(jié)果也顯示了這一點。從初步構(gòu)建腦衰老模型的角度出發(fā)，注射D-半乳糖可以起到一定的效果，且腹腔注射的效果好一些。

皮膚羥脯氨酸含量的下降可以顯示真皮內(nèi)膠原蛋白含量的降低，從而反映衰老程度〔11〕。實驗結(jié)果顯示腹腔注射組，皮下注射組與空白組相比皮膚羥脯氨酸含量明顯下降，而皮下注射組與腹腔注射組明顯降低。這與皮膚組織切片的結(jié)果一致。說明，皮下注射D-半乳糖的吸收途徑對皮膚的作用更加直接。因此，從實驗結(jié)果可見，在皮膚衰老模型的研究中，皮下注射D-半乳糖效果明顯優(yōu)于腹腔注射D-半乳糖構(gòu)建的大鼠模型，可以應(yīng)用于該領(lǐng)域模型的構(gòu)建。

腹腔注射和皮下注射D-半乳糖構(gòu)建的衰老大鼠模型，兩種方法均可建立穩(wěn)定可靠的衰老大鼠模型，且兩種模型均能在多層面上反映出機(jī)體的衰老情況。從應(yīng)用角度出發(fā)，腹腔注射D-半乳糖構(gòu)建的大鼠模型較皮下注射D-半乳糖構(gòu)建的大鼠模型在機(jī)體應(yīng)激研究、自由基代謝研究、腦衰老研究中有較好的效果。而皮下注射D-半乳糖構(gòu)建的大鼠模型較腹腔注射D-半乳糖構(gòu)建的大鼠模型在皮膚衰老模型的研究中效果更突出。

本文發(fā)現(xiàn)，注射D-半乳糖構(gòu)建衰老大鼠模型，腹腔注射的方法要比皮下注射方法造模效果更加明顯。這種差別可能是因為腹腔注射法是將D-半乳糖注射入腹腔胃腸道漿膜以外，腹膜以內(nèi)。由于腹膜的面積廣大且密布血管和淋巴管，因此腹膜有很強(qiáng)的吸收能力，每小時可吸收動物體重3% ～8%的液體，因而對血液指標(biāo)的影響更大。皮下注射D-半乳糖則是將D-半乳糖推入皮下結(jié)締組織，D-半乳糖經(jīng)皮下結(jié)締組織間的毛細(xì)血管、淋巴管吸收進(jìn)入血液循環(huán)，因而對皮膚組織和羥脯氨酸含量的影響更大。兩種不同的注射方法導(dǎo)致大鼠機(jī)體對D-半乳糖的藥代動力學(xué)差異，而藥代動力學(xué)上的差異是導(dǎo)致兩種衰老大鼠模型之間差異的主要原因。

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