趙 晶 畢旭東 穆長征 王曉梅

(遼寧醫(yī)學院組織胚胎學教研室，遼寧 錦州 121001)

肝臟缺血再灌注損傷(HIRI)是臨床肝臟外科常見的病理過程，它可使肝代謝解毒能力降低、微循環(huán)阻力升高，嚴重者可導致肝功能衰竭，直接影響到疾病的預后、手術(shù)成功率和病人存活率。因此，采取適宜的干預措施從而減少HIRI是肝臟手術(shù)成功的關鍵所在。導致HIRI的原因很多，確切的發(fā)生機制至今仍不十分清楚。為了減輕HIRI，國內(nèi)外學者做了大量的研究，目前預防HIRI的措施有藥物預處理、缺血預處理、局部熱應激預處理、熱休克預處理、亞低溫預處理、臭氧氧化預處理、缺氧預處理、缺血后處理等，在眾多處理措施中又以藥物預處理的應用前景最為廣闊。近年來，高滲鹽水的臨床作用也受到人們的關注。但是高滲鹽水用于治療HIRI的實驗研究報道不是很多?？聭c宏等〔1〕研究發(fā)現(xiàn)，高滲鹽水預處理明顯增強缺血/再灌注后肝臟血紅素加氧酶-1(HO-1)mRNA及蛋白表達，明顯改善肝臟微循環(huán)，對HIRI具有保護作用。本實驗通過建立大鼠HIRI模型，應用高滲鹽水來保護大鼠HIRI，并探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔健康雄性SD大鼠60只，清潔級，體重220～260 g，由遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑 一氧化氮(NO)試劑盒購于南京建成生物工程研究所，內(nèi)皮素-1(ET-1)、白介素-10(IL-10)、血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)測定試劑盒均購自中國人民解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免研究所。Bax/Bcl-2購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。細胞凋亡試劑盒(POD)購于羅氏公司。

1.3 動物分組及方法 健康SD大鼠隨機分為4組，每組15只大鼠，術(shù)前禁食12 h，自由飲水。Ⅰ組:假手術(shù)組(Sham組)，單純麻醉(10%水合氯醛腹腔注射麻醉，300 mg/kg)和開腹，分離出肝十二指腸韌帶，不阻斷肝門。Ⅱ組:缺血再灌注組(IR組)，麻醉后用無損傷動脈夾夾閉左肝葉、中肝葉肝蒂，40 min后移走動脈夾恢復灌流。開腹前10 min至陰莖背靜脈緩慢注射生理鹽水(10 ml/kg體重)。Ⅲ組:缺血預處理組(Ⅲ組，IP組)，缺血5 min，再灌注 5 min，重復2次后，缺血40 min。Ⅳ組:高滲鹽水預處理組(HTS組)，開腹前10 min至陰莖背靜脈緩慢注射7.5%氯化鈉注射液(10 ml/kg體重)。

1.4 取材 各組分別于再灌注1、6、24 h后至腹主動脈取血4 ml室溫靜置30 min，3 000 r/min離心30 min，提取血清標本－20℃保存待測 NO、ET-1、TNF-α 和 IL-10。取 1.0×1.0×0.5 cm3大小左肝固定部位的組織，置于10%中性甲醛溶液中固定，待做光鏡并觀察肝組織病理學改變。

1.5 指標測定

1.5.1 血清ALT、AST的測定 采用全自動生化分析儀測定。

1.5.2 NO和ET-1的測定 分別采用硝酸還原酶法和放射免疫法測定，按試劑盒說明書進行。

1.5.3 TNF-α和IL-10的測定 放免法測定，按試劑盒說明書進行。

1.5.4 肝臟組織病理學觀察 肝組織置于10%中性甲醛溶液中固定，石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察組織學變化。

1.5.5 免疫組化Bax/Bcl-2蛋白含量測定 采用免疫組化SP法檢測Bax及Bcl-2蛋白的表達。陽性標準為Bax、Bcl-2細胞質(zhì)染色均呈棕黃色。顯微鏡下觀察，每張片子隨機選取5個視野，利用MIAS-2000圖像分析陽性區(qū)域平均吸光度值(A)，以A值的大小表示陽性產(chǎn)物表達的多少。

1.5.6 凋亡指數(shù)(AI)檢測 采用TUNEL法檢測AI。鏡下觀察凋亡細胞，細胞核中有紫黑色為陽性細胞。每張片子在200倍高倍視野下隨機選取5個視野，計算出平均每100個細胞中的凋亡細胞數(shù)，并以百分數(shù)表示作為AI。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用方差分析和q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 血清生化酶學的改變 見表1，表2。肝臟缺血40 min再灌注1、6、24 h后Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組血清ALT、AST水平明顯高于Ⅰ組(P＜0.01);Ⅲ、Ⅳ組明顯低于Ⅱ組(P＜0.01);Ⅲ和Ⅳ組之間差異無顯著性(P＞0.05);ALT、AST的含量水平在1、6、24 h之間的變化以6 h最為顯著。

2.2 血清NO和ET-1水平 見表3、表4。肝臟缺血40 min再灌注1、6、24 h后血清NO水平Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組明顯低于Ⅰ組(P＜0.01)，而ET-1明顯高于Ⅰ組(P＜0.01);Ⅲ和Ⅳ組明顯高于Ⅱ組(P＜0.01)，而ET-1明顯低于Ⅱ組(P＜0.01);Ⅲ和Ⅳ組水平之間差異無顯著性(P＞0.05);NO和ET-1的含量水平在1、6、24 h之間的變化以6 h最為顯著。

表1 不同組血清AST的比較(x ±s，U/L，n=15)

表2 不同組血清ALT的水平(x ±s，U/L，n=15)

表3 各組血清NO的水平(x ± s，μmol/L，n=15)

表4 不同組血清ET-1水平(x ± s，ng/L，n=15)

2.3 血清 TNF-α和 IL-10水平 見表5、表6。肝臟缺血40 min再灌注1、6、24 h 后血清 TNF-α、IL-10 水平Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組明顯高于Ⅰ組(P＜0.01);IL-10水平Ⅲ和Ⅳ組明顯高于Ⅱ組(P＜0.01)，而TNF-α明顯低于Ⅱ組(P＜0.01);Ⅲ和Ⅳ組水平之間差異無顯著性(P＞0.05);TNF-α和IL-10的含量水平在1、6、24 h之間的變化以6 h最為顯著。

2.4 肝臟組織病理學 見圖1。光鏡下Ⅰ組肝索及肝竇排列規(guī)則。Ⅱ組肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，大量炎性細胞聚集、浸潤，肝小葉中央靜脈和肝血竇淤血明顯，肝竇狹窄，肝索竇排列不規(guī)則，肝細胞不同程度的腫脹及空泡樣變性，偶有點狀壞死;Ⅲ組肝小葉結(jié)構(gòu)尚可，部分肝細胞腫脹，變性，較Ⅱ組輕;Ⅳ組的肝小葉和肝血竇淤血程度較Ⅲ組輕，肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，細胞變性不明顯，炎性細胞浸潤少，未見明顯肝細胞壞死。

2.5 免疫組化法檢測肝組織Bax及Bcl-2的表達 見圖2，圖3，和表7，表8。Ⅰ組中Bax和Bcl-2表達較多，Ⅱ組Bax和Bcl-2的表達與Ⅰ組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);Ⅲ組較Ⅱ組Bcl-2的表達水平高，但低于Ⅳ組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。Ⅳ組及Ⅲ組較Ⅱ組Bax的表達水平低，Ⅲ組較Ⅱ組Bax的表達水平低，但高于Ⅳ組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

表5 不同組血清的TNF-α水平比較(x ± s，pg/ml，n=15)

表6 不同組血清的IL-10水平比較(x ± s，pg/ml，n=15)

表7 各組肝組織Bax蛋白的A值的變化(x ± s，n=15)

表8 各組肝組織Bcl-2蛋白的A值的變化(x ± s，n=15)

2.6 各組肝細胞凋亡情況 Ⅰ組肝組織僅見少量凋亡細胞，而Ⅱ、Ⅲ組及Ⅳ組凋亡細胞表達明顯增多(P＜0.01)，且AI隨再灌注時間的延長呈增加趨勢，Ⅳ組AI值較Ⅲ及Ⅱ組低，Ⅲ組AI值較Ⅱ組低，但高于Ⅳ組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。見圖4，表9。

圖1 各組再灌注6 h肝臟組織病理學表現(xiàn)(HE，×200)

圖2 各組再灌注6 h肝臟組織 Bax的表達(DAB，×200)

圖3 各組肝臟組織再灌注6 h Bcl-2的表達(DAB，×200)

圖4 各組肝臟組織凋亡情況(TUNEL，×200)

表9 各組再灌注不同時點肝細胞的AI的變化(x ± s，n=15)

3 討論

HIRI是一個有多種細胞參與、多種介質(zhì)共同作用、鈣離子超載、氧自由基形成、微循環(huán)紊亂和能量耗竭等多因素形成的復雜病理生理過程，臨床實踐中，如原位肝移植，復雜肝切除手術(shù)，休克復蘇會不可避免地導致肝臟缺血再灌注損傷。有研究表明HIRI后3～6 h，各種炎癥因子顯著升高，出現(xiàn)明顯的肝功能損害〔2，3〕。本實驗中以再灌注后 1、6、24 h 作為觀察時間點，可確切反映大鼠HIRI后的肝功能變化狀況。

小劑量高滲鹽水不僅能快速改善各種休克的血流動力學參數(shù)〔4〕，提高心肌收縮力和心排出量，增強微血管的反應性，改善微循環(huán)，而且還能抑制創(chuàng)傷應激狀態(tài)下的過度炎癥反應。高滲鹽水可抑制粒細胞過度激活，抑制促炎細胞因子TNF-α、IL-6及黏附分子的合成、分泌或表達〔4〕，同時，增加抗炎細胞因子IL-10的釋放與表達〔5〕，而發(fā)揮抗炎作用。高滲鹽水調(diào)節(jié)中性粒細胞的毒性反應與調(diào)節(jié)中性粒細胞的細胞骨架有關，它能減弱中性粒細胞胞外信息的傳遞〔6〕。高滲鹽水預處理還明顯增強缺血/再灌注后肝臟血紅素加氧酶-1(HO-1)mRNA及蛋白表達〔1〕，在HIRI前進行高滲鹽水預處理，具有明顯抑制再灌注后外周血中性粒細胞Mac-1表達和肝內(nèi)ICAM-1的表達的作用，明顯減輕再灌注后肝臟中性粒細胞浸潤;同時肝細胞及肝竇內(nèi)皮細胞濁腫、變性程度減輕，肝臟微循環(huán)得到明顯改善。

本研究說明高滲鹽水預處理對HIRI具有明顯的保護作用。IR時，肝細胞受到嚴重的損害，產(chǎn)生大量的ET-1受ETA受體介導，引起肝血管強烈收縮，使肝臟血流循環(huán)阻力增加，加重肝臟瘀血，肝臟缺血缺氧狀況更為嚴重，氧自由基、細胞內(nèi)鈣離子超載及各種炎性因子等大量釋放，引起再灌注損傷。ET-1還可激活中性粒細胞，增加內(nèi)皮細胞黏附分子的表達，促進中性粒細胞與內(nèi)皮細胞的黏附等。ET縮血管作用所激發(fā)的自由基、興奮性氨基酸毒性、細胞內(nèi)鈣離子超載以及細胞致使平衡失調(diào)因子為再灌注損傷的重要原因。

NO是一種具有多種生物活性的小分子物質(zhì)，是一氧化氮合酶(NOS)的終產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)簡單、半衰期短、化學性質(zhì)活潑，廣泛存在于生物體內(nèi)各組織器官，參與機體內(nèi)多種生理及病理過程，如血管張力的調(diào)節(jié)，神經(jīng)傳遞，抗微生物及免疫調(diào)節(jié)。肝臟是具有多種復雜功能的機體重要器官，所有肝臟細胞均可生成NO〔7〕。NO能與肝細胞內(nèi)細胞色素酶系統(tǒng)結(jié)合改變活性來影響肝臟的藥物代謝和生物轉(zhuǎn)化。Nishida等〔8〕認為，當內(nèi)毒素引起肝臟微循環(huán)變化時，NO具有穩(wěn)定微循環(huán)、增強肝臟抗缺血和抗氧化的能力。在內(nèi)毒素水平較低的情況下，肝臟非實質(zhì)細胞產(chǎn)生大量NO對維持肝臟微循環(huán)起重要作用。因此，NO在肝內(nèi)的作用和影響相當復雜。

NO和ET是體內(nèi)最強的血管舒張和收縮因子，在生理情況下，兩者之間可通過負反饋調(diào)節(jié)保持動態(tài)平衡，ET與血管內(nèi)皮ETB受體結(jié)合，可以促進NO釋放，而NO又可以抑制ET釋放，相互作用，相互依賴，維持著動態(tài)平衡，共同精確調(diào)節(jié)血管活性〔9〕，但在許多應激狀態(tài)下，它們的平衡失調(diào)可影響疾病的發(fā)生和發(fā)展。

本實驗研究了大鼠肝臟缺血再灌注NO與ET之間平衡關系的改變及其與HIRI的關系。在肝臟缺血再灌注時期，ET濃度明顯增高，而NO濃度明顯降低。ET濃度增高一方面是因為缺氧及胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高促使內(nèi)皮細胞產(chǎn)生ET，另一方面在再灌注時期內(nèi)由門靜脈進入肝臟內(nèi)的腸源性內(nèi)毒素也可刺激內(nèi)皮細胞產(chǎn)生ET。ET濃度增高將導致微血管收縮，肝臟血流減少而引起肝微循環(huán)功能障礙，繼而導致肝細胞損傷。再灌注之后，NO生成是減少的。主要原因可能是缺血期肝臟損傷而釋放出大量的精氨酸酶，再灌注后精氨酸酶進人體循環(huán)，使體內(nèi)L-精氨酸(NO的供體)大量消耗，NO生成原料不足。NO濃度降低可反饋性促進ET產(chǎn)生而加重其收縮血管效應，同時使NO抑制黏附分子的表達及抑制血小板聚集的功能減弱而導致肝細胞損傷。

TNF-α主要由激活的巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、中性粒細胞及B細胞分泌，是具有多功能的多肽，它在炎癥反應過程中起著較為重要的作用。肝臟是體內(nèi)最大的巨噬細胞池，是產(chǎn)生TNF-α的主要器官〔10〕。肝臟富含TNF-α受體，是 TNF-α作用的主要靶器官。TNF-α通過多種機制誘導肝臟損傷。TNF-α可誘導其他細胞因子的產(chǎn)生及活化中性粒細胞和內(nèi)皮細胞。灌注細胞因子如TNF-α可由于中性粒細胞、血管內(nèi)皮細胞相互作用引起肝臟細胞、分子和微循環(huán)障礙。大量的研究資料表明，肝臟缺血再灌注后可以通過壞死和凋亡兩條途徑引起細胞死亡，TNF-α在此過程中起著十分重要的作用〔11〕。缺血時肝細胞受損，引起細胞內(nèi)Ca超載，再灌注時Ca超載加重。Kupffer細胞因Ca超載而活化，分泌釋放大量的TNF-α。TNF-α的過量表達引起大量肝細胞損害，直接導致肝竇內(nèi)皮細胞腫脹，肝臟微循環(huán)功能障礙。TNF-α對肝臟損傷的作用機制表現(xiàn)為:直接對肝細胞損傷;對內(nèi)皮細胞產(chǎn)生毒性作用，導致肝血竇微循環(huán)障礙;活化中性粒細胞和單核巨噬細胞，并誘導IL-1、IL-6等基因表達，活化磷脂酶A2(PLA2)，使花生四烯酸分解，產(chǎn)生血小板活化因子(PAF)、白三烯(LT)、血栓素A2(TXA2)等炎癥介質(zhì)，加劇炎癥反應;介導脂類介質(zhì)及其他多肽介質(zhì)的產(chǎn)生;TNF-α能激活補體系統(tǒng)，通過其細胞毒性作用加劇組織損傷;此外，肝臟是自由基產(chǎn)生的主要部位，TNF-α可以誘導氧自由基的產(chǎn)生;促進中性粒細胞“氧化爆發(fā)”，產(chǎn)生氧自由基等活性氧介質(zhì)并導致肝臟損傷。

IL-10作為體內(nèi)炎癥反應過程中的內(nèi)生性抗炎細胞因子，可以抑制多種細胞合成炎癥介質(zhì)，具有強有力的抗炎作用，但其具體的抗炎機理尚不清楚。近年來的研究證實IL-10是一個多效性的細胞因子，具有廣泛的生物學作用〔12，13〕。它是抑制單核細胞/巨噬細胞功能的細胞素，能抑制許多前炎癥相關因子的產(chǎn)生，包括 TNF-α、IL-1、IL-6、MIP-1 和 IL-8;抑制 Th1 淋巴細胞產(chǎn)生IFN-g和IL-2。Ke等〔14〕認為IL-10抑制IL-6的產(chǎn)生對HIRI產(chǎn)生保護作用。IL-10還可以增強血紅素加氧酶-1(HO-1)的表達，而發(fā)揮強大的抗炎作用。IL-10通過抑制核因子-κB(NF-κB)的活化，導致各種促炎細胞因子(IL-1、IL-6和TNF等)的產(chǎn)生減少。

本研究驗證了高滲鹽水預處理能夠減輕肝細胞的損傷，減輕肝臟的瘀血程度，改善微循環(huán)功能障礙，對肝臟缺血再灌注具有保護作用。其保護機制可能是抑制促炎細胞因子TNF-α、增加抗炎細胞因子IL-10的釋放與表達，減少中性粒細胞介導的炎性反應所致組織的損傷。

Bcl-2是重要的抗凋亡基因，在缺血再灌注中表現(xiàn)尤為突出〔15，16〕。研究發(fā)現(xiàn)〔17〕肝細胞 Bcl-2 基因表達明顯抑制了肝臟缺血再灌注時的肝細胞凋亡。Bcl-2家族包括 Bcl-2亞家族、Bax亞家族和BH3亞家族等。在體內(nèi)，多以二聚體形式發(fā)揮作用，并呈現(xiàn)兩種不同的作用:Bax二聚體形成時誘導并促進細胞凋亡，隨著Bcl-2的表達上升，促進 Bax/Bax分離，形成更穩(wěn)定的Bax/Bcl-2從而抑制凋亡;當Bcl-x存在時，可先與Bcl-2形成異二聚體，使游離Bax形成二聚體而促進凋亡。Bcl-2與Bax表達水平的平衡決定了凋亡信號刺激后細胞的存活或凋亡。炎癥反應是肝臟缺血再灌注損傷的重要組成部分，主要由炎癥細胞介導，特別是Kupffer細胞。Kupffer細胞及內(nèi)皮細胞能在肝臟遭遇缺血再灌注損傷時，釋放大量炎性介質(zhì)及炎性因子。而這些介質(zhì)及因子均為肝臟缺血再灌注損傷的始動因素，在眾多炎癥介質(zhì)及細胞因子中，TNF-α起著十分重要的作用。缺血時肝細胞受損，引起細胞內(nèi)鈣超載，再灌注時鈣超載加重。Kupffer細胞因鈣超載而活化，釋放大量的TNF-α，從而引起大量肝細胞損害〔18〕。本研究發(fā)現(xiàn)高滲鹽水可以抑制肝細胞的凋亡，其機制可能在于抑制Bax的表達，增加Bcl-2的表達。

缺血預處理是HIRI的保護措施之一〔19〕，肝組織經(jīng)短暫的重復缺血能增加對缺血的耐受性，減輕隨后較長時間的缺血造成的損傷，IP涉及的機制尚不完全清楚，有待更進一步研究。

總之，高滲鹽水及缺血預處理均對HIRI有保護作用。且前者的保護作用優(yōu)于后者。高滲鹽水能夠減少Bax的表達促進Bcl-2的表達，同時又能抑制TNF-α的產(chǎn)生、增強IL-10的表達水平來增強抗炎作用，抑制HIRI時肝細胞的凋亡。高滲鹽水預處理操作方便，適用范圍廣，為臨床肝臟外科減輕HIRI提供有價值的實驗依據(jù)，具有廣泛的臨床應用前景和價值。

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