王翠艷 魏芳晶 陰淑瑩 李云霞 張曉云 喬曉娟 石秀換

(內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院保健中心一病區(qū)，內蒙古 呼和浩特 010050)

骨髓間充質干細胞(MSCs)〔1〕是從骨髓中分離培養(yǎng)出的一種多潛能干細胞，具有很強的自我復制和多向分化潛能，可產生具有各種表型的子代細胞，還能通過與造血細胞密切接觸，分泌細胞外基質和多種細胞調節(jié)因子調節(jié)造血，并且可分泌多種生長因子和細胞因子。研究表明〔2〕，MSCs還能分化為心肌細胞，能補充丟失的心肌細胞，促進血管新生，從而修復受損心肌，改善心功能。另外，MSCs自體移植可避免免疫抑制劑的使用，同時MSCs易于外源基因的轉染和表達，從而增強或調控移植后的治療作用。因此MSCs被用作表達目的基因的細胞平臺，在治療缺血性心肌病方面?zhèn)涫荜P注。本文根據MSCs貼壁生長的特性進行分離和培養(yǎng)，并觀察其生長形態(tài)，對其表型和生長曲線進行初步鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 DMEM培養(yǎng)基(低糖)(GibcoBRL公司)，胎牛血清(天津TBD灝洋有限公司)4%臺盼藍母液(上海亞培生物科技有限公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)，兔抗大鼠CD34、CD44單抗(博奧森公司)，SP試劑盒 (福建邁新公司)，DAB顯色試劑盒(北京中杉公司)，F(xiàn)ITC抗大鼠/小鼠CD90.1單抗(Ebioscience公司)、超凈臺(北京半導體設備一廠)、CO2培養(yǎng)箱(SNAYO公司)、倒置顯微鏡。

1.2 實驗方法

1.2.1 MSCs分離、純化及培養(yǎng) 取6 w左右體重120～150 g雄性大鼠，斷頸處死，無菌條件下分離脛骨、股骨，全骨髓培養(yǎng)法提取細胞，放于胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，搖勻后放入37℃，5%CO2箱中進行培養(yǎng)。提取細胞3 d后首次換液，此后每隔3天換一次液。原代培養(yǎng)時生長較慢約14 d左右達90%融合，0.25%胰酶消化約1 min左右進行傳代，首次傳代后生長較快，約每7天傳一次代。通過貼壁培養(yǎng)法和嚴格控制酶的量和消化時間，利用MSCs較易脫落的特點，保證MSCs在短暫的作用時間內與培養(yǎng)瓶底分開，從而使MSCs得到純化。

1.2.2 繪制MSCs生長曲線 取生長良好的1、3代細胞，0.25%胰蛋白酶消化，以5×106/ml密度接種于24孔板中，每孔400μl，至于37℃，5%CO2箱中進行培養(yǎng)。第二天(大約30 h后)開始每隔24 h取4孔，用臺盼藍法進行讀數。連續(xù)讀14 d。以培養(yǎng)時間為橫軸，細胞數為縱軸，描繪生長曲線。

1.2.3 MSCs表型分析 取第3代生長狀態(tài)良好的細胞，制成細胞爬片，4%多聚甲醛固定，PBS沖洗，過氧化氫消除內源性過氧化物酶，滴加非免疫動物血清，加一抗(兔抗大鼠 CD44、CD34)，同時用 PBS作為一抗設置陰性對照，4℃濕盒過夜，加生物素化二抗，加 SABC，DAB顯色，蘇木素染色，脫水、封片、顯微鏡下觀察。取第3代生長狀態(tài)良好的細胞，制成單細胞懸液，以2×106細胞/ml，500μl分裝于3支1.5 mlEP管中，其中2支加抗大鼠CD90-FITC，一支加PBS，混勻，避光孵育，加1 ml PBS混勻，用流式細胞儀檢測細胞表面抗原CD90表達。

2 結果

2.1 細胞培養(yǎng) 見圖1初接種的細胞呈圓形，24 h時部分細胞開始貼壁，72 h時貼壁細胞明顯增多，部分細胞伸出偽足呈紡錘樣、長梭形，細胞核較大，呈圓形或橢圓形，核膜邊界清楚。更換培養(yǎng)液。接種第1周內，細胞增殖緩慢，10 d后細胞增殖速度明顯加快，第12～14天時細胞集落達90%融合。傳代后細胞生長速度明顯加快，于6～8 h開始貼壁，24 h后開始分裂，生長迅速，培養(yǎng)6～7 d可達90%融合。第3代以后細胞純度較高，以梭形細胞為主，排列有一定的方向性，呈漩渦樣生長，漩渦中心細胞呈多層分布，細胞界限不清。

圖1 MSCs生長狀態(tài)(×200)

2.2 繪制MSCs生長曲線 原代接種后的1～5 d為MSCs生長的潛伏期，此期主要為MSCs的貼壁生長階段，培養(yǎng)細胞的有絲分裂活動不甚活躍;約7 d后，細胞生長速度開始加快;10 d后細胞生長達指數生長期;第14天達到高峰進入平臺期。傳代細胞的生長速度較原代快，潛伏期為24 h，3～4 d細胞生長達指數生長期;接種后7 d達到高峰，然后生長逐漸緩慢，進入平臺期。見圖2。

圖2 MSCs生長曲線

2.3 MSCs表型特征 免疫細胞化學染色顯示3代細胞CD44為陽性反應，可見細胞膜呈棕黃色著色，胞漿輕度著色;而造血干細胞和淋巴細胞的標志CD34免疫組化染色為陰性。表明MSCs有CD44抗原表達，具有間質細胞的標志。見圖3。流式細胞分析法檢測表面標志物顯示均一的表達MSCs標志CD90，陽性99%以上。

圖3 免疫組化法MSCs細胞表面標志表達(×200)

3 討論

骨髓來源的干細胞主要包括造血干細胞〔3〕(HSCs)、MSCs和血管內皮祖細胞(EPCs)。MSCs來源于中胚層，能夠支持和維持造血微環(huán)境。在調節(jié)造血干細胞的長期存活及生長分化過程中起重要作用，且能夠分化成多種中胚層來源的間葉組織細胞。最早在1867年Cobnhein首次提出骨髓具有造血以外的功能，直到1968年才被在實驗中發(fā)現(xiàn)和命名。1997年Asahara T等在體外成功的分離培養(yǎng)出MSCs。MSCs的突出特點是具有自我更新和多向分化潛能。在不同的誘導條件下可以向不同的胚系分化，而且可以跨胚層分化〔4〕。

目前已經建立了多種體外分離、純化、培養(yǎng)MSCs的方法:①貼壁篩選法，②密度梯度離心法，③流式細胞儀分選法，④免疫磁珠法。本實驗采用的是貼壁篩選法，將骨髓細胞直接進行貼壁培養(yǎng)，通過反復、多次換液去除未貼壁的造血干細胞，獲得貼壁生長的MSCs，用L-DMEM+15%FBS作為基本培養(yǎng)基，通過換液、傳代進行純化和擴增培養(yǎng)。文獻報道〔5〕體外培養(yǎng)的MSCs，在形態(tài)上呈紡錘形成纖維細胞狀，能附著在塑料或玻璃培養(yǎng)皿上生長，形成均勻的集落或貼壁的融合層，而無明顯的接觸抑制。本研究也證實了上述觀察結果。從細胞生長曲線上可以看出，無論原代培養(yǎng)還是傳代培養(yǎng)，各代細胞均具有明顯的潛伏期、對數增長期和平臺期，具有常規(guī)細胞體外培養(yǎng)的特點。MSCs是一群具有獨特表型及細胞化學特征的處于未分化狀態(tài)的非定向干細胞〔6〕，MSCs可以表達細胞因子(IL-1a、IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、IL-12、SCF、LIF、M-CSF 等);細胞因子受體(IL-1R、IL-3R、IL-7R、G-CSFR、PDGFR 等);MSC 的表型不均一，具有間質細胞、上皮細胞和內皮細胞的特點，即MSCs可以表達多種黏附相關分子，如整合素亞基a3、a4、a5、β以及整合素 avβ3、avβ5、ICAM-1、CD44H 等。它對表面抗原 SB-10、SH-2、SH-3、SH-4、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、和 CD124等均呈陽性反應，而對造血細胞的CD14、CD34、CD45抗原均呈陰性反應。本實驗觀察了MSCs細胞3種表面分子抗原的表達顯示:CD44，CD90陽性而CD34陰性，均符合已有證實的結果。

綜上，本研究建立了采用貼壁篩選法體外分離純化MSCs方法分離純化所得的MSCs純度高，具有干細胞特征，適用于基因治療和細胞治療，為下一步研究奠定基礎。

1 Jain M，Pfister O，Roger J，et al.Mesenchymal stem cells in the infarcted heart〔J〕.Coronary Artery Dis，2005;16(2):93-7.

2 Herzog EL，Chai L，Krause DS，et al.Plasticity of marrow-derived stem cells〔J〕.Blood，2003;102(10):3483-93.

3 范阜東，王東進.骨髓干細胞移植治療缺血性心臟病的現(xiàn)狀與前景〔J〕.心血管病學進展，2008;29(5):778-81.

4 Lorena Zentilin，Sabrina Tafuro，Serena Zacchigna，et al.Bone marrow mononuclear cells are recruited to the sites of VEGF-induced neovascularization but are not incorporated into the newly formed vessels〔J〕.Blood，2006;107(9):3546-54.

5 華 平，陳 炬，張惠忠，等.血管內皮生長因子基因轉染骨髓間充質干細胞移植于梗死心肌的實驗研究〔J〕.中華顯微外科雜志，2006;29(5):947-51.

6 Gao F，He T，Wang H，et al.A promising strategy for the treatmen to fischemic heart disease:mesenchymal stem cell-mediated vascular endothelial growth factor gene transfer in rats〔J〕.Can JCardiol，2007;23:891-8.