滕麗莉 趙蔭濤 邵 莉 江 華 張代富 張 華

(同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，上海 200120)

慢性心力衰竭(CHF)是各種原發(fā)性或繼發(fā)性心血管疾病發(fā)展到一定階段的共同表現(xiàn)，不僅嚴(yán)重危害人類的健康，而且對患者、家庭和社會帶來了沉重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。目前，世界各國CHF的發(fā)生率均呈上升趨勢，死亡率居高不下。由于心衰的高發(fā)病率及高病死率，CHF的發(fā)病機(jī)制及治療歷來都是人們研究的重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)主要采用阿霉素誘導(dǎo)建立大鼠心衰模型，使用魚油對心衰大鼠進(jìn)行干預(yù)，旨在探討魚油對阿霉素誘導(dǎo)的心力衰竭大鼠的心肌結(jié)構(gòu)和細(xì)胞因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性SD大鼠46只(購于復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部)，稱重(250±20)g。隨機(jī)分成2組:對照組(n=10)和阿霉素組(n=36)。

1.2 試劑與儀器 小動物高分辨率體內(nèi)超聲檢測儀;高頻超聲探頭(加拿大Visual Sonics公司);阿霉素(注射用鹽酸多柔吡星，浙江海正藥業(yè)股份有限公司);鹽酸氯胺酮注射液(江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司);CM1900冰凍切片機(jī)(Leica公司);酶標(biāo)儀(MK3，芬蘭Thermo);大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-αELISA試劑盒，大鼠白介素(IL)-10 ELISA試劑盒(均為上海西唐生物科技有限公司進(jìn)口分裝)。

1.3 大鼠CHF模型的建立 大鼠腹腔注射阿霉素溶液1 ml/kg(按2 mg/kg阿霉素，用生理鹽水配成2 mg/ml，即1 ml/kg阿霉素，根據(jù)體重變化調(diào)整藥物劑量，每周1次，造模時間共持續(xù)8 w，累計用量約16 mg/kg)。對照組大鼠腹腔注射等體積的無菌生理鹽水(注射時間同阿霉素組，共8 w)。實(shí)驗(yàn)過程中定期觀察大鼠的精神狀態(tài)、活動量、進(jìn)食量、體重等大體情況。

1.4 超聲心動圖對動物模型進(jìn)行評價 大鼠腹腔注射氯胺酮(2 ml:0.1 g，對照組按100 mg/kg，ADR組按70 mg/kg)全身麻醉，8%Na2S脫去大鼠前胸部皮毛。采用小動物高分辨率體內(nèi)超聲檢測儀vevo770模式，在給藥后行經(jīng)胸高頻超聲心動檢查。在二維切面上顯示胸骨旁左心長軸，M型超聲心動圖法測量，測量指標(biāo)有左室舒張末期內(nèi)徑(LVDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVSD)等，并自動計算出左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)。所有指標(biāo)均在3個連續(xù)的心動周期中完成，獲取數(shù)據(jù)存儲于光盤中。所有測量工作均由有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師在同一超聲儀上完成。

1.5 魚油干預(yù)結(jié)束后采用超聲心動圖進(jìn)行評價 造模后的26只阿霉素組大鼠隨機(jī)分為2組:心衰組和魚油組，每組13只，以及對照組大鼠10只，每周測體重一次，根據(jù)體重調(diào)整藥物劑量。魚油組(n=13):劑量按體重的0.6%灌胃，每天1次，共8 w;心衰組(n=13):等量生理鹽水灌胃，共8 w;對照組(n=10):等量生理鹽水灌胃，共8 w。實(shí)驗(yàn)過程中定期觀察大鼠的精神狀態(tài)、活動、毛色、進(jìn)食、腹水、體重等大體情況。干預(yù)結(jié)束后再次用同樣的方法對心衰組及魚油組大鼠進(jìn)行超聲心動圖檢查。

1.6 心肌HE染色 斷頭處死所有大鼠，取心肌組織先經(jīng)液氮速凍，放置－80℃冷凍后制備冰凍切片，常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察其組織學(xué)特點(diǎn)。

1.7 細(xì)胞因子的檢測 斷頭處死大鼠時留取抗凝血4 ml，于4℃下1 500 r/min離心10 min，取上清，分裝凍存于－80℃ 冰箱，集中采用ELISA法檢測TNF-α和IL-10水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)用x±s表示。

2 結(jié)果

2.1 造模結(jié)束后超聲心動圖指標(biāo) 動物均分籠飼養(yǎng)在18℃ ～20℃SPF環(huán)境中，自由取食和飲水，第8周末共有26只阿霉素組大鼠存活。造模結(jié)束后給兩組大鼠做心臟超聲，結(jié)果發(fā)現(xiàn)阿霉素組存活的大鼠心腔普遍擴(kuò)大，室壁活動度減弱，均出現(xiàn)心功能指標(biāo)異常，LVDD、LVSD明顯升高，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，LVEF和LVFS明顯低于對照組(P＜0.05)，表明有左心室收縮功能障礙。對照組大鼠超聲心動圖檢查均未發(fā)現(xiàn)心功能異常。見表1。

表1 正常對照組和阿霉素組大鼠第8周末超聲心動圖心功能指標(biāo)(x±s)

2.2 魚油干預(yù)結(jié)束后超聲心動圖進(jìn)行評價 與對照組相比，心衰組LVDD、LVSD均顯著增加(P＜0.05)，LVEF、LVFS均降低(P＜0.05)。而魚油組LVDD、LVSD均較心衰組顯著降低(P＜0.05)，LVEF、LVFS均較心衰組顯著增加(P＜0.05)。見表 2，圖 1。

圖1 3組大鼠心臟超聲比較

表2 各組大鼠心臟超聲指標(biāo)比較(x±s)

2.3 心肌形態(tài)結(jié)構(gòu)改變 圖2可見，心肌組織HE染色顯示:對照組心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞間隙正常，胞核清晰，高倍鏡下可見清晰橫紋，未見胞體水腫，組織間隙無炎性滲出;心衰組大鼠心肌細(xì)胞失去正常結(jié)構(gòu)形態(tài)、排列明顯不規(guī)則、部分呈水腫和空泡變性，部分出現(xiàn)灶性壞死，部分心肌纖維出現(xiàn)溶解斷裂，心肌細(xì)胞間隙明顯增寬，可見中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的浸潤;PUFA組可見心肌細(xì)胞變性和壞死，心肌細(xì)胞間隙增寬，但程度和范圍均較心衰組減輕。

圖2 光鏡下大鼠心肌組織HE染色圖片(×400)

2.4 細(xì)胞因子的變化 與對照組相比，心衰組TNF-α和IL-10濃度升高，且上調(diào)IL-10/TNF-α比值(P＜0.05);與心衰組相比，魚油組TNF-α和IL-10濃度降低，且下調(diào)IL-10/TNF-α比值(P＜0.05)。見表3。

表3 各組大鼠TNF-α、IL-10和IL-10/TNF-α 的變化(x ± s，pg/ml)

3 討論

CHF是指于心排出量絕對或相對減少，不能滿足機(jī)體組織需要的一種病理生理狀態(tài)。目前用于CHF動物模型的制作方法較多，主要有以下幾大類:①壓力超負(fù)荷所致，包括有主動脈縮窄，主動脈狹窄，肺動脈縮窄，肺動脈狹窄和實(shí)驗(yàn)性高血壓動物〔1〕;②容量超負(fù)荷過度所致，包括快速大量輸液，二尖瓣關(guān)閉不全，主動脈瓣關(guān)閉不全，動靜脈瘺，下腔靜脈狹窄〔1〕;③心臟快速起搏所致〔1〕;④結(jié)扎冠狀動脈或冠脈內(nèi)注入微栓子〔1〕;⑤遺傳性心衰模型〔2〕;⑥心肌毒性及抑制藥物:如阿霉素多用于建立慢性心衰模型，普萘洛爾、戊巴比妥鈉、維拉帕米多用于建立急性心衰模型〔1〕。

阿霉素是一種廣譜高效的蒽醌類腫瘤化療藥物，對白血病、淋巴瘤等多種腫瘤的化療效果良好。由于它的心肌組織高親和性而具有嚴(yán)重的心臟毒性，長期大劑量使用會引起中毒性心肌炎、心肌病和心律失常，甚至出現(xiàn)嚴(yán)重的心力衰竭。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)阿霉素組大鼠在給藥第2周后普遍出現(xiàn)了食欲下降、活動量減少、發(fā)紺、腹瀉、口鼻周圍有粉紅色分泌物等CHF的常見表現(xiàn)，并且心臟超聲檢查結(jié)果顯示給藥組大鼠心臟擴(kuò)大，心腔擴(kuò)大，室壁活動度明顯減弱，LVEF值逐漸降低，大鼠LVDD進(jìn)行性增加，心室收縮和舒張功能均減退，均與人類臨床擴(kuò)張型心肌病特征相符，因此該實(shí)驗(yàn)提供了建立阿霉素大鼠的心肌病及CHF模型的方案。

魚油中富含一系多不飽和脂肪酸，尤其是其中的廿碳五烯酸，和廿二碳六烯酸，具有降低血脂、抗血栓形成、延緩動脈粥樣硬化和冠狀動脈成形術(shù)后再狹窄閉、抗心律失常、影響血壓及改善血液流變學(xué)等多種心血管效應(yīng)〔3〕。目前各國研究者在魚油的作用機(jī)制及其對機(jī)體的損害、應(yīng)用等方面的研究已取得很大進(jìn)展，魚油制劑在人類心血管疾病防治工作中的地位日益受到重視。一項大規(guī)模的臨床研究〔4〕結(jié)果顯示，在指南心力衰竭標(biāo)準(zhǔn)治療的基礎(chǔ)上，相對于一種常用降膽固醇藥，魚油補(bǔ)充劑對治療CHF可能更有效。本結(jié)果說明細(xì)胞因子之間的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控參與了心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展;利用HE組織切片染色證實(shí)了魚油對阿霉素誘導(dǎo)的心衰大鼠的保護(hù)作用。TNF-α具有許多不良作用〔5〕，包括心室重構(gòu)、心肌抑制、心肌細(xì)胞凋亡等，TNF-α在體內(nèi)外均有負(fù)性肌力作用。近年來IL-10在多種心血管病的發(fā)生發(fā)展中的作用均有報道，有研究表明〔6〕IL-10作為一種抗炎性細(xì)胞因子，能中和充血性心力衰竭過程中產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子，可直接對抗心肌由炎性細(xì)胞因子介導(dǎo)的損害，對心臟有保護(hù)作用。Yamaoka等〔7〕觀察68例各種原因的CHF患者和31例正常對照患者的循環(huán)IL-10和IL-10受體水平，發(fā)現(xiàn)CHF組IL-10和TNF-α水平均高于對照組。應(yīng)用魚油干預(yù)阿霉素致心衰大鼠8 w后，心衰組大鼠血清的炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-10表達(dá)水平顯著下降。IL-10/TNF-α比值也較心衰組降低，該比值反映促炎抗炎平衡狀態(tài)，越接近平衡狀態(tài)越有利于炎癥性疾病的恢復(fù)。因此，我們推測n-3PUFAs可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子TNF-α和IL-10等的表達(dá)來改善心功能。這與文獻(xiàn)報道的多不飽和脂肪酸攝入量和炎癥細(xì)胞因子的相關(guān)性是一致的。魚油的抗炎作用已經(jīng)有很多相關(guān)報道〔6，8〕，許多研究結(jié)果表明，飲食攝入足量的魚油對減少心衰患者的炎癥因子水平是有益的。

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6 Aukrust P，Ueland T，Lien E，et al.Cytokine network in congestive heart failure secondary to ischemic or idiopathic dilated cardiomyopathy〔J〕.Am JCardiol，1999;83(3):376-82.

7 Yamaoka M，Yamaguchi S，Okuyama M，et al.Anti-inflammatory cytokine profile in human heart failure:behavior of interleukin-10 in association with tumor necrosis factor-alpha〔J〕.Jpn Circ J，1999;63(12):951-6.

8 Hoorn EJ，Geary D，Robb M，et al.Acute hyponatremia related to intravenous fluid administration in hospitalized children:an observational study〔J〕.Pediatrics，2004;113(5):1279-84.