張鳳香 關 寧 李晨光 孫大鵬 羅俊生

(遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院心外科，遼寧 錦州 121001)

血管平滑肌細胞(VSMC)位于血管中膜，是血管中層惟一的細胞成分，VSMC既可以調(diào)節(jié)血管張力，又可以維持血管功能。研究表明VSMC的增殖、遷移是高血壓、動脈粥樣硬化血管重塑等內(nèi)膜增厚性疾病的重要病理生理因素。microRNA和一般的RNA一樣都是由基因編碼的。microRNAs的基因廣泛存在于各個染色體中，這些microRNAs雖然只占人類基因總數(shù)的2%，卻調(diào)控著人類30%以上的基因表達。研究發(fā)現(xiàn)多個MicroRNA在血管平滑肌細胞中特異表達，并可以對血管平滑肌細胞的增殖和遷移進行調(diào)節(jié)，從而影響動脈粥樣硬化斑塊的形成。MicroRNA-29 a不但參與腫瘤形成、免疫炎癥反應、細胞因子分泌、葡萄糖代謝等過程，還可以在VSMC大量表達。因此，本實驗就MicroRNA-29a對VSMCs增殖和遷移的影響進行研究，以探討其治療心腦血管性疾病的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠，100～180 g(武漢大學實驗中心);DMEM、胎牛血清(Hyclone公司);胰蛋白酶、CCK8試劑盒(GIBCO公司);MicroRNA-29 a反義寡核苷酸(上海生工);兔抗鼠PCNA抗體、兔抗鼠 MMP-9、MMP-2抗體、小鼠抗β-actin單克隆抗體、PCR試劑盒、HRP標記山羊抗小鼠二抗(北京中杉金橋公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)及轉染 選取100～180 g雄性 SD大鼠，取胸腹主動脈血管中膜，用貼塊法分離、培養(yǎng) VSMC。細胞在含10%FBS的DMEM中生長至匯合后，0.25%胰蛋白酶消化傳代，取3～6代細胞進行實驗。MicroRNA-29 a反義寡核苷酸轉染按照lipofectamine2000說明書操作，將VSMC分為3組:空白對照組(加入同等量的lipofectamine2000);MicroRNA-29 a反義寡核苷酸(50 nmol/L)組:MicroRNA-29a錯義鏈(50 nmol/L)組，5 h后換完全培養(yǎng)基，顯微鏡下觀察轉染效率。

1.3 MTT法檢測VSMCs活力 將處于對數(shù)生長期的 VSMC接種于96孔板中，每孔1×104個細胞，貼壁后轉染，分別于轉染后24 h、48 h、72 h用MTT法檢測細胞增殖狀態(tài)。每組每孔取200μl加入96孔板板中，每孔加入20μl 5 mg/ml的MTT液，37℃5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去上清，每孔加入100μl DMSO充分溶解。用酶標儀測定各孔吸光度值，波長570 nm。

1.4 劃痕法檢測VSMCs遷移 取對數(shù)生長期VSMCs接種于培養(yǎng)皿，調(diào)整細胞濃度以致第2天覆蓋達到約90%，按上述分組進行轉染。在培養(yǎng)皿底部做一直線標記，用無菌槍頭在無菌條件下沿標記線作劃痕，PBS液漂洗后加入含1%FBS的DMEM，孵育12 h后重新加入含10%FBS的 DMEM，37℃、5%CO2培養(yǎng)。分別在0、24、48、72 h于各組鏡下隨機選取10個視野進行拍攝，測量兩邊細胞遷移邊緣之間的距離即劃痕寬度，然后取均值。

1.5 Western印跡檢測MMP-9、MMP-2和PCNA蛋白的表達轉染48 h后常規(guī)提取總蛋白，每孔加入20μl蛋白溶液，電泳分離后轉膜，體積分數(shù)5%牛奶封閉2 h，加入一抗，4℃孵育過夜。TBST清洗后，加入二抗孵育1 h，TBST清洗。加入ECL發(fā)光液100μl，在ImageQuant RT ECL冷 CCD成像系統(tǒng)進行顯影，用Imagequant TL軟件進行半定量分析。

1.6 RT-PCR檢測相關mRNA的表達 轉染48 h后收集并計數(shù)各組細胞，用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，經(jīng)紫外分光光度計檢測RNA濃度，參照反轉錄試劑盒說明書進行發(fā)轉錄反應。反轉錄PCR法檢測;PCNA:正義鏈5'-ACCACCATCACCACCATCATC-3'，反 義 鏈'-TGGAAGAGTTGGAGCACAGG-3';MMP-9:正義鏈 5'-GAACATCATCCCTGCCTCCAC-3'，反義鏈'-GCCTGCTTCACCACCTTCTTG-3';MMP-2:正 義 鏈 5'-GUAAUCGAGAGGCUGAGUA-3'，反 義 鏈 5'-UACUCAGCCUCUCGAUUAC-3';MicR-29a:正義鏈5'-GGAGAGGAACTGGACTGGCTC-3'，反義鏈'-CCAGCCAAGGTTGAGGTTGCA-3';β-actin:正義鏈5'-GTCGAGACACGATGGTGAAGGT-3'，反義鏈5'-TTCTCAGCCACCGTGCCG-3'。擴增條件:第一步:95℃ ×30 s;第二步:95℃ ×5 s，60℃ ×10 s，72℃ ×15 s，循環(huán)35 次。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS13.0 for windows統(tǒng)計軟件進行處理。數(shù)據(jù)以x±s表示，各組數(shù)據(jù)進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，兩樣本的均數(shù)比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 MicroRNA-29 a對VSMCs活力的影響 結果顯示，與陰性對照組和空白對照組相比較，MicroRNA-29 a反義寡核苷酸組VSMCs體外增殖能力明顯被抑制 (P＜0.05)，而陰性對照組與空白對照組之間比較無顯著差異 (P＞0.05)，說明抑制MicroRNA-29 a的表達可以抑制 VSMCs的增殖(見表1)。

表1 MicroRNA-29 a對VSMCs體外增殖的影響(x ± s，n=6)

2.2 MicroRNA-29 a對VSMCs遷移能力的影響 結果顯示，在0 h時劃痕寬度均為(380.71±9.12)μm。隨著時間的延長，與陰性對照組和空白對照組比較，MicroRNA-29 a反義寡核苷酸組VSMCs遷移能力明顯被抑制(P＜0.05)，而空白對照組與陰性對照組相比無明顯差異(P＞0.05)，說明抑制MicroRNA-29 a的表達能顯著抑制VSMCs的遷移(見表2)。

2.3 MicroRNA-29 a對MMP-9、MMP-2和PCNA mRNA表達的影響 轉染48 h后，與陰性對照組和空白對照組比較，MicroRNA-29 a反義寡核苷酸組MMP-9、MMP-2和PCNA mRNA表達明顯被抑制(P＜0.05)，而空白對照組與陰性對照組相比無明顯差異(P＞0.05)(見圖1)。

2.4 MicroRNA-29 a對MMP-9、MMP-2和PCNA蛋白表達的的影響 作用48 h，Western印跡檢測結果發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組和空白對照組比較，MicroRNA-29 a反義寡核苷酸組 MMP-9、MMP-2和PCNA蛋白表達均明顯被抑制，而空白對照組與陰性對照組相比無明顯差異(見圖2)。

表2 MicroRNA-29 a對VSMCs遷移能力的影響(μm，x ± s，n=6)

圖2 Western印跡檢測microRNA-29a對VSMC中MMP-9、MMP-2和PCNA表達的影響

3 討論

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個miRNA在VSMC中特異表達，并能調(diào)節(jié)VSMC的增殖和遷移，從而影響高血壓和動脈粥樣硬化斑塊的形成過程。研究發(fā)現(xiàn)MicroRNA145是正常血管壁和血管平滑肌細胞中最多表達的MicroRNA，并能抑制血管新生內(nèi)膜的生長〔1〕。Elia等〔2〕發(fā)現(xiàn) Microrna145 和 Microrna143 對血管平滑肌的表型及分化有調(diào)節(jié)作用。Liu等〔3〕發(fā)現(xiàn)低表達的MicroRNA221和MicroRNA222基因能抑制血管平滑肌細胞的增殖。MicroRNA-29 a是一個遺傳上高度保守的miRNA，在體內(nèi)幾乎所有的細胞內(nèi)表達。已經(jīng)證實MicroRNA-29 a參與腫瘤形成、免疫炎癥反應、細胞因子分泌、葡萄糖代謝等過程。在心血管系統(tǒng)中MicroRNA-29 a不但與心臟纖維化相關，還與動脈粥樣硬化的形成有關〔4〕，但MicroRNA-29 a是否參與VSMC的增殖和遷移尚不見報道。本研究說明MicroRNA-29 a可以影響VSMC的增殖和遷移。PCNA是一種分子量為36 kD的核蛋白，在VSMC的增殖中起重要作用，當VSMC發(fā)生增殖時，PCNA的表達量明顯升高〔5〕。本文表明MicroRNA-29 a反義寡核苷酸組PCNA的表達也被明顯抑制?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)通過降解ECM，導致血管中層VSMC遷移至內(nèi)膜，這與AS斑塊形成病理過程密切相關〔6〕。本研究結果表明，MicroRNA-29 a反義寡核苷酸組能更有效地抑制MMP-2和MMP-9的表達。

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2 Elia L，Quintavalle M，Zhang J，et al.The knockout of miR-143 and miR-145 alters smooth muscle cell maintenance and vascular homeostasis in mice:correlates with human disease〔J〕.Cell Death Differ，2009;16(12):1590-8.

3 Liu X，Cheng Y，Zhang S，et al.A necessary role of miR-221 and miR-222 in vascular smooth muscle cell proliferation and neointimal hyperplasia〔J〕.Circ Res，2011;104(4):476-87.

4 van RE，Sutherland LB，Thatcher JE，et al.Dysregulation of microRNAs after myocardial infarction reveals a role of miR-29 in cardiac fibrosis〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2008;105:13027-32.

5 Li GH，Chen YF，Stacey SK，et al.Estrogen attenuates integrin-3-dependent adventitial fibroblast migration after inhibition of osteopontin production in vascular smooth muscle cell〔J〕.Circulation，2000;101:2949-55.

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