何玉萍 匡忠生 何玉珊 許翌嘉

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，廣東 廣州 510405)

血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)是循環(huán)血液與血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的中介，不僅起到屏障作用，而且還具有活躍的內(nèi)分泌功能，通過釋放生物活性物質(zhì)參與多種生理及病理過程。動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是以VEC和細(xì)胞間大量脂質(zhì)堆積、單核或巨噬細(xì)胞浸潤、泡沫細(xì)胞形成、VSMC增殖為特征〔1〕。VEC的慢性損傷是AS發(fā)生的先決條件及重要機(jī)制〔2〕。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)可對(duì)VEC產(chǎn)生毒性作用，是引起內(nèi)皮損傷的一個(gè)重要的有害因子，是AS形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素〔3，4〕。本文研究探討ox-LDL對(duì)人血管臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV304)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度、線粒體膜電位(MMP)、凋亡率以及內(nèi)皮細(xì)胞損傷條件下對(duì)VSMC增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 ECV304細(xì)胞株(中山大學(xué)細(xì)胞庫);VSMC細(xì)胞株(廣州中醫(yī)藥大學(xué)傷寒研究室惠贈(zèng))。

1.2 主要試劑與儀器 RPMI1640培養(yǎng)基(美國GIBCO);胎牛血清(美國GIBCO);低密度脂蛋白(LDL，美國SIGMA);噻唑藍(lán)(MTT，AMRESCO產(chǎn)品);鈣離子熒光探針(Fluo-3/AM，Bio-Rad產(chǎn)品);Rhodamine123(Rh123，BIOCHEMICALS);碘化丙啶染色液(PI，BECKMAN COULTER公司產(chǎn)品);流式細(xì)胞儀(美國BECKMAN COULTER公司 ALTRA型)，四色熒光，配套EXPO32采集分析軟件，MultiCycle分析軟件。

1.3 ox-LDL的制備 將LDL置于含10μmol/L CuSO4的PBS(pH7.2)溶液中，37℃溫育24 h，再將溶液置含200μmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)的PBS中，在4℃中透析24 h，超濾除菌后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 ox-LDL對(duì)ECV304損傷的影響及條件培養(yǎng)基制備 細(xì)胞以5×105個(gè)/ml細(xì)胞數(shù)接種入24孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長至穩(wěn)定狀態(tài)(約24 h)，ox-LDL組加入25μg/ml ox-LDL，正常對(duì)照組加等量生理鹽水，置于37℃、5%CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，收集兩組培養(yǎng)基(條件培養(yǎng)基)，超濾除菌后，－20℃保存?zhèn)溆?。培養(yǎng)板的細(xì)胞用PBS輕洗2遍，用2.5 g/L胰蛋白酶和0.2 g/L EDTA-Na2混合液消化，收集單細(xì)胞懸液檢測指標(biāo)。

1.4.1 MTT法檢測細(xì)胞活性 細(xì)胞以5×104個(gè)/ml細(xì)胞數(shù)接種入96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長至穩(wěn)定狀態(tài)(約24 h)，ox-LDL組加入25μg/ml ox-LDL，正常對(duì)照組加等量生理鹽水，置于37℃、5%CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 g/L的MTT 10μl，培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入150μl二甲基亞砜(DMSO)，置微量振蕩器上振蕩10 min，酶標(biāo)儀(波長570 nm)測定吸光值(OD)。

1.4.2 細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度檢測 戊二酰氧甲基脂 (Fluo-3)是一種新型的Ca2+熒光指示劑，能與Ca2+高度特異性地結(jié)合，依賴脂溶性乙酰氧甲基(AM)酯化后就容易跨過質(zhì)膜進(jìn)入胞質(zhì)，在胞漿內(nèi)與游離Ca2+結(jié)合。采用FCM測定其平均熒光強(qiáng)度可反映細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化，熒光強(qiáng)度與胞內(nèi)Ca2+濃度成正比。檢測方法:單細(xì)胞懸液，加入終濃度為5μmol/L的Fluo-3/AM，在37℃水浴45 min，PBS洗細(xì)胞2次，加0.5 ml PBS重懸細(xì)胞，F(xiàn)CM檢測，用EXPO32采集分析軟件分析Ca2+平均熒光強(qiáng)度。

1.4.3 ECV304線粒體膜電位測定〔5〕Rh123是一種陽離子親脂性熒光染料，對(duì)細(xì)胞膜具有通透性，由于活細(xì)胞線粒體內(nèi)外膜之間存在著跨膜電位，因而Rh123進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后能特異地聚集于線粒體，其攝入量與線粒體膜電位成正比，熒光強(qiáng)度變化可反映線粒體膜電位變化。檢測方法:單細(xì)胞懸液，PBS洗細(xì)胞2次，加入終濃度為1μmol/L Rh123，37℃避光孵育30 min后，PBS洗細(xì)胞2次，再用PBS重懸細(xì)胞，F(xiàn)CM檢測并用EXPO32采集分析軟件分析其平均熒光強(qiáng)度。

1.4.4 細(xì)胞凋亡率檢測 收集ECV304單細(xì)胞固定于70%冰乙醇中，加蓋置4℃冰箱固定24 h后，取固定細(xì)胞1 000 r/min離心去除乙醇，加PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞數(shù)(1×106)，加入PI熒光染液(含RNase)1 ml避光孵育25 min，進(jìn)行FCM檢測。采集3×104個(gè)細(xì)胞，采用MultiCycle軟件分析細(xì)胞凋亡率。

1.5 ox-LDL誘導(dǎo)ECV304損傷培養(yǎng)基對(duì)VSMC增殖的影響取VSMC接種于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，24 h后換成無血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h使細(xì)胞同步化，再換相應(yīng)的ECV304條件培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，去培養(yǎng)液，PBS洗2次，用2.5 g/L胰蛋白酶和0.2 g/L EDTA-Na2等量混合液消化，收集VSMC單細(xì)胞并固定于70%冰乙醇中，加蓋置4℃冰箱固定24 h后，1 000 r/min離心去除乙醇，加PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞數(shù)(1×106)，加入PI熒光染液1 ml避光孵育25 min，進(jìn)行FCM檢測，采集3×104個(gè)細(xì)胞，運(yùn)用MultiCycle軟件進(jìn)行分析VSMC周期各時(shí)相DNA百分率(G0/G1、S、G2/M)及增殖指數(shù)〔增殖指數(shù)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%〕。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1 ox-LDL損傷ECV304 ox-LDL致ECV304細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)在細(xì)胞活力降低，Ca2+超載，MMP下降，細(xì)胞凋亡率明顯增高，與正常組比較有非常顯著差異(P＜0.01，P＜0.001)。見表1。

2.2 ECV304損傷培養(yǎng)基對(duì)VSMC增殖影響 ECV304損傷培養(yǎng)基使VSMC處于G0/G1期的細(xì)胞百分明顯減少，S期和G2/M期的細(xì)胞明顯增多，增殖指數(shù)增高，與正常組比較有非常顯著差異(P＜0.01，P ＜0.001)。見表2。

表1 ox-LDL致人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷(x ± s，n=10)

表2 ox-LDL誘導(dǎo)VEC損傷條件培養(yǎng)基促VSMC增殖的影響(x ± s，n=10)

3 討論

AS常見于中老年人，其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，目前許多學(xué)者已從細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)方面對(duì)AS的發(fā)病機(jī)理進(jìn)行大量研究，提出VEC功能損傷是AS發(fā)生的始動(dòng)因素，VSMC 增殖在 AS 病理過程發(fā)揮重要作用〔2，6，7〕。Ca2+作為信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)中的第二信使，在傳遞細(xì)胞信息、調(diào)控各種細(xì)胞效應(yīng)和維持細(xì)胞正常生理功能等過程中起重要作用。Ca2+超載，可導(dǎo)致細(xì)胞損傷及死亡〔8〕。線粒體是細(xì)胞能量代謝場所，參與細(xì)胞凋亡的重要細(xì)胞器。MMP是線粒體功能的重要參數(shù)，是評(píng)價(jià)線粒體功能的敏感指標(biāo)，它的大小直接反映線粒體功能及數(shù)量〔9〕。研究表明，細(xì)胞凋亡的最早期階段在細(xì)胞核病理改變出現(xiàn)前MMP就已下降，MMP降低是細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)的標(biāo)志〔10〕。研究發(fā)現(xiàn)，VEC凋亡可引發(fā)血管調(diào)節(jié)功能失衡，促進(jìn)VSMC的增殖、遷移〔11〕。

ox-LDL具有的細(xì)胞毒性和自由基作用，是內(nèi)皮細(xì)胞較為敏感的一種刺激因子，對(duì)VEC產(chǎn)生毒性作用，而且還通過多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)通路改變內(nèi)皮細(xì)胞分泌活性，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)，造成VEC損傷，促使VSMC增殖和內(nèi)膜異常增生，降低內(nèi)源性抗AS的機(jī)制〔3，4，12〕。本實(shí)驗(yàn)通過 ox-LDL 對(duì) ECV304 細(xì)胞 Ca2+濃度、MMP以及細(xì)胞凋亡率的影響，探討ox-LDL致VEC損傷機(jī)制，結(jié)果表明ox-LDL導(dǎo)致VEC損傷，引起細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度升高，致的線粒體功能障礙，促進(jìn)細(xì)胞凋亡;并且改變內(nèi)皮細(xì)胞分泌活性，引發(fā)血管調(diào)節(jié)功能失衡，其損傷的培養(yǎng)液促進(jìn)VSMC增殖、遷移，可能是最終導(dǎo)致AS的發(fā)生發(fā)展機(jī)制之一。

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