李 洋 馬程遠(yuǎn) 郭健杏 田明堯 金寧一 華樹成

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，吉林 長春 130021)

盡管傳統(tǒng)的A型H1N1流感病毒不是當(dāng)前的流行毒株，但是它可以持續(xù)不斷地變異和重組，一旦A型H1N1流感病毒通過抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)換機(jī)制獲得強(qiáng)致病能力，會(huì)對人類健康造成的巨大威脅。A型流感病毒基因組RNA在復(fù)制過程中高達(dá)10－4的錯(cuò)配率及機(jī)體免疫和藥物治療的選擇壓力，使病毒不斷地變異與進(jìn)化〔1〕，造成了流感流行與爆發(fā)。而現(xiàn)有的疫苗和藥物不能有效控制該病毒感染。尋找一種新的抗流感病毒方法迫在眉睫。在病毒基因中往往越保守的序列就越重要，如果能封閉或抑制病毒基因的某些保守序列發(fā)揮功能，就可以抑制病毒基因的表達(dá)，抵抗病毒感染。

因此，本實(shí)驗(yàn)利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)進(jìn)行抗A型H1N1流感病毒的體外研究，選擇在A型H1N1流感病毒復(fù)制過程中起重要作用的RNA聚合酶PA編碼基因中的高度保守序列作為靶序列，觀察誘導(dǎo)PA基因沉默情況，為預(yù)防與治療流感尋找一種有效的措施。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)備 A/NewCaledonia/20/99(H1N1)毒株及馬丁-達(dá)比狗腎(MDCK)細(xì)胞由本室保存。各種限制性內(nèi)切酶及熒光定量PCR試劑盒(SYBR Premix Ex TaqTM)購自TaKaRa公司;T4連接酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司;RNA提取試劑Trizol購自GIBCO公司;轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司;鼠源NP單抗由本室提供;辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG單抗、DAB為鼎國公司產(chǎn)品;pSilencer 5.1-U6表達(dá)性載體(Ambion)，ABI 7300熒光定量PCR儀(美國ABI公司);熒光顯微鏡(OLYMPUS)。

1.2 方法

1.2.1 siRNA的設(shè)計(jì)合成及表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)siRNA的設(shè)計(jì)原則，以A型H1N1毒株P(guān)A基因?yàn)榘谢?，選擇其高度保守區(qū)，設(shè)計(jì)了特異性siRNA的DNA寡核苷酸序列，GC含量為30%～50%，BLAST分析使其不針對任何已知的其他基因，符合siRNA設(shè)計(jì)原則。由上海生工生物有限公司合成，序列如下:PA646:5'-GATCCGCTTCTCCTGCATTGAGAATTTCAAGAGA ATTCTCAATGCAGGAGAAGTTTTTTGGAAA-3'，5'-AGCTTTTCC AAAAAACTTCTCCTGCATTGAGAATTCTCTTGAAATTCTCAATG CAGGAGAAGCG-3'，PA841:5'-GATCCATTCCTGCTGATGGATTCTTTCAAGAGAAGAATCCATCAGCAGGAATTTTTTTGGAAA-3'，5'-AGCTTTTCCAAAAAAATTCCTGCTGATGGATTCTTCTCTT GAAAGAATCCATCAGCAGGAATG-3'，PA1537:5'-GATCCGTGACACCGATGTGGTAAACTTCAAGAGAGTTTACCACATCGGTGTCA TTTTTTGGAAA-3'，5'-AGCTTTTCCAAAAAATGACACCGATGTGGTAAACTCTCTTGAAGTTTACCACATCGGTGTCACG-3'，序列合成后參照pSilencerTM5.1 Retro Kit操作說明構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pSPA646、pS-PA841、pS-PA1537，之后測序鑒定。

1.2.2 病毒培養(yǎng)及血凝效價(jià)測定 病毒經(jīng)絨毛尿囊腔接種10日齡雞胚，37℃培養(yǎng)。48 h收獲尿囊液，－80℃貯存。在96孔V形板測定病毒血凝價(jià)(HA)，病毒經(jīng)2倍倍比稀釋，加入等量1%雞紅細(xì)胞懸液(V/V)置微量振蕩器上混合均勻，室溫靜置20 min，以完全凝集的病毒最大稀釋度作為病毒效價(jià)(HA)。1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及病毒感染 常規(guī)方法培養(yǎng)MDCK細(xì)胞于細(xì)胞瓶中，加入含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿形成單層后，0.5%胰酶(體積分?jǐn)?shù))消化，分裝于6孔細(xì)胞板，1×107細(xì)胞/孔，待細(xì)胞單層達(dá)到80%左右，按照LipofectamineTM2000的說明書分別轉(zhuǎn)染 3μg的 pS-PA646、pS-PA841、pSPA1537，未轉(zhuǎn)染的MDCK細(xì)胞孔作為空白對照。轉(zhuǎn)染后18 h，棄去轉(zhuǎn)染混合物，每孔加入103TCID50病毒液150μl于室溫吸附1 h，吸附后清洗細(xì)胞后，加入2 ml含2μg/ml TPCK-胰酶的病毒生長液于37℃體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間收獲上清液，測定病毒HA。

1.2.4 病毒與 siRNA接種雞胚 取30μl、10μg siRNA的DMEM，同30 μl Oligofectamine(Invitrogen)混合〔2〕，室溫孵育30 min，之后同103TC ID50病毒液100μl一起經(jīng)絨毛尿囊腔接種10日齡雞胚，37℃培養(yǎng)，17 h后收獲尿囊液測定病毒效價(jià)。

1.2.5 反轉(zhuǎn)錄與real-time PCR 將MDCK細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板，1×107細(xì)胞/孔，待細(xì)胞單層達(dá)到80%左右，按照 LipofectamineTM2000的說明書分別轉(zhuǎn)染 3μg的 pS-PA646、pSPA841、pS-PA1537和 Ps-negative，轉(zhuǎn)染后 18 h，棄去轉(zhuǎn)染混合物，每孔加入103TC ID50病毒液150μl，接種病毒后8 h，提取總RNA，用oligo d(T)5'-TTTTTTTTTTTTTTT-3'反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板，取2μl進(jìn)行real-time PCR，用ABI 7300熒光定量PCR儀檢測熒光信號，用2△△ct法計(jì)算PA基因mRNA相對表達(dá)水平，抑制效果以siRNA組與對照組差異的倍數(shù)表示。PA的擴(kuò)增引物序列如下:Pa1:CCTATGTGGATGGATTCGAAC，Pa2:TGGTCGTGGTGTTGTTTTC;β-actin1:CAGAGCAAGAGGGGCATC，β-actin2:AGGTAGTCGGTCAGGTCC。

1.2.6 間接免疫熒光試驗(yàn) MDCK細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板，待細(xì)胞單層達(dá)到80%左右，按照LipofectamineTM2000的說明書分別轉(zhuǎn)染pS-PA646、pS-PA841、pS-PA1537，未轉(zhuǎn)染的 MDCK 細(xì)胞孔作為空白對照。轉(zhuǎn)染18 h后攻毒，未攻毒的MDCK細(xì)胞孔作為細(xì)胞對照。攻毒24 h后去除上清，80%冷丙酮37℃固定2 h，PBS洗3次，鼠源NP單抗作為一抗，37℃孵育1 h，PBS洗3次。FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗(含0.1%伊文思藍(lán))，37℃孵育1 h，熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)質(zhì)粒抑制病毒在MDCK細(xì)胞中復(fù)制的結(jié)果 siRNA轉(zhuǎn)染 MDCK后 24 h、48 h、72 h收獲上清液，利用公式〔(HA對照組－HA實(shí)驗(yàn)組)/HA對照組×100〕計(jì)算抑制效率，結(jié)果見表1。轉(zhuǎn)染MDCK后24 h收獲的上清液，HA均為0，所以表中未列出?？辙D(zhuǎn)染對照組的HA在48～72 h之間達(dá)到高峰。而pSPA1537在病毒滴度的高峰時(shí)間其HA值僅為32±4，表明它們在一定程度上能夠抑制H1N1在MDCK細(xì)胞中復(fù)制，其病毒抑制率在78%以上。其他siRNA轉(zhuǎn)染組，其血凝效價(jià)與空轉(zhuǎn)染對照組相似，其抑制效果不顯著。

表1 特異性siRNA對H1N1在MDCK中增殖的影響(x±s)

2.2 表達(dá)質(zhì)粒抑制病毒在雞胚中的復(fù)制結(jié)果 表達(dá)質(zhì)粒抑制病毒在雞胚中復(fù)制結(jié)果與MDCK細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。MDCK、pS-PA646、pS-PA841、pS-PA1537 組的 HA 分別為 256 ±37、180±31、220±17、48±9，siRNA 表達(dá)質(zhì)粒(pS-PA1537)可以有效抑制H1N1流感病毒在雞胚中的復(fù)制。因此，siRNAs還可以干擾H1N1亞型流感病毒在雞胚中的復(fù)制。

2.3 各組mRNA表達(dá)水平 pS-negative、pS-PA646、pS-PA841、pS-PA1537組的pA mRNA表達(dá)量分別為13.5±0.7、7.5±0.4、9.6±0.5、4.3±0.2。PA1537能顯著抑制H1N1基因在MDCK中的表達(dá)，而pS-PA646、pS-PA841對PA基因的表達(dá)干涉作用不顯著。感染后8 h，PA1537使PA mRNA的表達(dá)水平較對照組降低了3倍。

2.4 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與空白對照組相比，pS-PA1537熒光信號明顯減弱。相反，pS-PA646、pS-PA841組與空白對照組相比信號減弱不明顯。結(jié)果表明，pS-PA1537可以抑制流感病毒蛋白在MDCK中的表達(dá)及病毒復(fù)制。

3 討論

本研究應(yīng)用RNAi技術(shù)，選擇MDCK細(xì)胞及雞胚作為宿主，以對A型H1N1流感病毒復(fù)制起重要作用的PA基因保守序列為作用靶點(diǎn)，成功地構(gòu)建了哺乳動(dòng)物細(xì)胞pS-PA646、pSPA841、pS-PA1537表達(dá)載體，對A型H1N1流感病毒的PA基因從轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行了抑制，并在核酸水平進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明，pS-PA1537重組質(zhì)粒能抑制目的基因PA的RNA轉(zhuǎn)錄水平。HA結(jié)果表明，在分別轉(zhuǎn)染pS-PA1537的MDCK細(xì)胞及雞胚中，流感病毒的增殖受到了不同程度的抑制，為進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。定量PCR顯示pS-PA1537表達(dá)的siRNA能夠靶向前基因組mRNA，使RNA水平降低。pS-PA1537相比pS-PA646、pS-PA841抑制效果更好，可能的原因是靶位點(diǎn)選擇的差異。

應(yīng)用siRNA進(jìn)行流感病毒的抗病毒研究已取得進(jìn)展，Ge等〔3，4〕設(shè)計(jì)了針對 H1N1 亞型流感病毒基因組(NP、PA、PB1)保守區(qū)的siRNA，能夠抑制流感病毒在細(xì)胞或雞胚中的增殖。Tompkins等〔5〕將合成的siRNA導(dǎo)入小鼠，明顯降低了感染鼠肺中的流感病毒滴度，保護(hù)鼠免于致死性流感病毒的攻擊，并證明這種保護(hù)是特異性的，而不是由抗病毒干擾素應(yīng)答介導(dǎo)的。本試驗(yàn)較其他研究中的抑制效率略有下降，其原因可能包括以下幾方面:(1)與實(shí)驗(yàn)操作和技術(shù)有一定的關(guān)系。(2)病毒的逃逸。H1N1的頻繁突變與RNAi的高度序列性之間的矛盾是設(shè)計(jì)siRNA的難點(diǎn)，雖然選擇在病毒高度保守區(qū)設(shè)計(jì)siRNA，但本毒株在保存過程中也可能造成靶基因的突變或堿基的缺失，導(dǎo)致病毒的逃逸。(3)siRNA的設(shè)計(jì)。目前各種siRNA設(shè)計(jì)原則不統(tǒng)一，各公司使用不同的規(guī)則篩選siRNA，也導(dǎo)致不是所有的siRNA都有抑制效果。(4)合成的siRNA質(zhì)量不穩(wěn)定等。siRNA干擾現(xiàn)象是一個(gè)很復(fù)雜的過程，而且到目前為止仍然有許多機(jī)制不清，不同的siRNA抑制效果可能受到目標(biāo)序列位置、GC含量、二級結(jié)構(gòu)等多種因素的影響。

盡管RNAi技術(shù)有許多明顯的優(yōu)點(diǎn)，但也存在一些限制因素，如siRNA并不是對所有的靶向基因都有作用，而是有選擇性的，它對某些靶向基因可能表現(xiàn)出較強(qiáng)的干擾作用，但對其他靶向基因卻表現(xiàn)出較弱的效應(yīng)。甚至無效應(yīng)。對同一靶向基因mRNA來說，可能某些siRNA對其有較強(qiáng)的抑制作用，而另一些siRNA卻只有較弱的抑制作用或無作用〔6〕。

在siRNA應(yīng)用方面也有許多問題需要解決，如靶位的選擇、怎樣設(shè)計(jì)出有效地siRNA序列，如何有效的將siRNA分子轉(zhuǎn)運(yùn)到靶器官并進(jìn)入靶細(xì)胞，給藥方式、怎樣提高siRNA的穩(wěn)定性、聯(lián)合用藥、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及作用機(jī)制等方面，這些都有待于進(jìn)一步的研究。

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2 Elbasir SM，Harborth J，Lendeckel W，et al.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells〔J〕.Nature，2001;411(6836):494-8.

3 Ge Q，McManus MT，Nguyen T，et al.RNA interference of influenza virus production by directly targeting mRNA for degradation and indirectly inhibiting all viral RNA transcription〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2003;100(5):2718-23.

4 Ge Q，F(xiàn)ilip L，Bai A，et al.Inhibition of influenza virus production in virus-infected mice by RNA interference〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2004;101(23):8676-81.

5 Tompkins SM，Lo CY，Tumpey TM，et al.Protection against lethal influenza virus challenge by RNA interference in vivo〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2004;101(23):8682-6.

6 Holen T，Amarzguioui M，Wiiger MT，et al.Positional effects of short interfering RNAs targeting the human coagulation trigger tissue factor〔J〕.Nucleic Acids Res，2002;30(8):1757-66.