劉 瑞 高維娟 錢 濤 王 利

(承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北 承德 067000)

腦缺血再灌注損傷是指缺血腦組織在一定條件下恢復(fù)血液供應(yīng)后，出現(xiàn)了更加嚴(yán)重的腦功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷，常見于休克、DIC微循環(huán)再通、腦血管栓塞再通、心肺腦復(fù)蘇等。缺血性腦血管疾病〔1〕是臨床神經(jīng)科的常見疾病，其致殘、致死率高，治療原則是及時(shí)恢復(fù)缺血區(qū)的血液供應(yīng)，但同時(shí)也造成了再灌注損傷，抑制再灌注損傷已成為治療缺血性腦血管疾病的重要環(huán)節(jié)〔2〕。本實(shí)驗(yàn)通過建立全腦缺血再灌注大鼠模型，觀察大鼠全腦缺血再灌注損傷后海馬超微結(jié)構(gòu)及凋亡蛋白激活因子(Apaf)-1表達(dá)的變化，探討腦缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康雄性SD大鼠，SPF級(jí)動(dòng)物，體重260～280 g，鼠齡2～3個(gè)月，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號(hào):SCXK(京)2009-0004。SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后隨機(jī)分為假手術(shù)組和模型組，其中模型組根據(jù)再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)再分為2、24、72 h 3個(gè)亞組。

1.2 試劑和儀器 小鼠抗大鼠Apaf-1單克隆抗體，小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司;免疫組化試劑盒購自北京中山金橋公司;HRP-DAB底物顯色試劑盒購自北京天根生化科技有限公司;BCA蛋白定量試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;其他試劑為國產(chǎn)分析純。WH-A300W型高頻電刀:北京市朝陽維思通工程電器廠生產(chǎn);石蠟包埋機(jī)，石蠟切片機(jī):德國LEICA生產(chǎn);光學(xué)顯微鏡:日本OLYMPUS生產(chǎn);H-7650透射電子顯微鏡:日本日立公司生產(chǎn);TDL-40B離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器制造廠;DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀:北京六一儀器廠。

1.3 模型制備 采用改良的Pulsinelli四血管阻斷法制作大鼠全腦缺血再灌注模型:大鼠于術(shù)前12 h禁食，4 h禁水，4%水合氯醛10 ml/kg腹腔注射麻醉。將大鼠俯臥位固定于固定臺(tái)上，頸背側(cè)正中縱切口約1.5 cm，逐層鈍性分離頸旁肌暴露雙側(cè)第一頸椎橫突翼狀孔，用直徑0.5 mm的電凝針燒灼其中的椎動(dòng)脈，造成永久性閉塞，縫合切口。然后將大鼠仰臥位固定，行腹側(cè)頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈并以“4”號(hào)線穿線備用，縫合切口。24 h后將大鼠乙醚麻醉，迅速打開頸部切口暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈，待大鼠清醒后用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈造成全腦缺血，缺血30 min后松開無創(chuàng)動(dòng)脈夾恢復(fù)腦血液灌流，觀察大鼠行為學(xué)改變，以雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉后1 min內(nèi)大鼠意識(shí)喪失、眼球變白、雙側(cè)瞳孔散大、對(duì)光反射消失、翻正反射消失作為全腦缺血模型成功的標(biāo)準(zhǔn)，且剔除全身強(qiáng)直、抽搐等異常反應(yīng)或死亡的大鼠。假手術(shù)組只做皮膚切口和組織分離。

1.4 電鏡樣品及標(biāo)本制備 每組于再灌注后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)從每組大鼠中隨機(jī)選取6只4%水合氯醛腹腔注射麻醉，先經(jīng)左心室灌注250 ml生理鹽水，再灌注含2.5%戊二醛的4%多聚甲醛300 ml，之后立即斷頭取腦，在冰上分離出海馬，將海馬CA1區(qū)切成1 mm3的小塊，迅速置于2.5%戊二醛中固定4 h，1%鋨酸后固定，常規(guī)梯度丙酮脫水，Epon812包埋，半薄切片選區(qū)，超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重電子染色，透射電鏡下觀察。

1.5 免疫組化法檢測海馬組織Apaf-1的表達(dá) 每組于再灌注后的相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)從每組大鼠中隨機(jī)選取6只，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)左心室快速灌注250 ml生理鹽水，然后灌注4%多聚甲醛500 ml進(jìn)行固定，取視交叉后4 mm與小腦前之間的部分即海馬腦組織，4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片，制成5μm厚切片。采用SP法檢測Apaf-1的表達(dá)，具體操作依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。小鼠抗大鼠Apaf-1單克隆抗體按1∶75稀釋，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。選用Med6.0軟件測定陽性反應(yīng)物灰度值:在切片的海馬CA1區(qū)各選取3個(gè)測量點(diǎn)，首先測定各點(diǎn)的顆粒細(xì)胞層灰度值，再用該值減去相應(yīng)的背底灰度值后求平均值，即為大鼠海馬CA1區(qū)Apaf-1表達(dá)的免疫反應(yīng)灰度值。

1.6 Western印跡法檢測海馬組織Apaf-1蛋白的表達(dá) 每組取6只大鼠海馬組織(－80℃保存)，提取總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，取80μg蛋白樣品，以8%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，分離的蛋白用半干電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，小鼠抗大鼠Apaf-1單克隆抗體(1∶200稀釋)4℃孵育過夜，山羊抗小鼠二抗(1∶5 000稀釋)室溫?fù)u床孵育1 h，洗膜后，采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，目的條帶為130 kD，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。用凝膠分析軟件Quantity one進(jìn)行定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 結(jié)果以x±s表示，用SPSS11.5軟件采用單因素方差分析，方差齊者用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者用Games-Howell檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化 透射電鏡下觀察:假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)元胞核較大，呈圓形或橢圓形，核膜清晰完整，可見核孔，常染色質(zhì)呈細(xì)顆粒狀，均勻分布，胞漿內(nèi)可見豐富的細(xì)胞器，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)形態(tài)清晰。模型2 h組可見大鼠海馬神經(jīng)元核膜鄒縮、凹陷，核染色質(zhì)密度增高，線粒體輕微腫脹，可見溶酶體;模型24 h組可見大鼠海馬神經(jīng)元核膜鄒縮凹陷嚴(yán)重，核仁物質(zhì)增多、偏移，線粒體結(jié)構(gòu)松散、空泡狀，線粒體嵴斷裂或消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊性變、脫顆粒，游離核糖體減少，可見溶酶體結(jié)構(gòu)完整;模型72 h組可見大鼠海馬神經(jīng)元核固縮，核染色質(zhì)成團(tuán)塊狀邊集于核膜下，線粒體不同程度脫空，可見溶酶體。見圖1。

2.2 免疫組化法檢測海馬組織Apaf-1蛋白表達(dá) 免疫組化染色結(jié)果:陽性反應(yīng)為胞漿呈棕黃色。假手術(shù)組海馬只有少量Apaf-1蛋白表達(dá)，與假手術(shù)組相比，模型組各時(shí)間點(diǎn) Apaf-1蛋白表達(dá)平均灰度值均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖 2，表 1。

2.3 Western印跡法檢測海馬組織Apaf-1蛋白表達(dá) Apaf-1蛋白表達(dá)趨勢與免疫組化表達(dá)一致，見圖3，表1。

表1 腦缺血再灌注后大鼠海馬組織Apaf-1蛋白表達(dá)(x ± s，n=6)

圖1 各組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)(×20 000)

圖2 各組海馬組織Apaf-1蛋白表達(dá)(×400)

圖3 各組大鼠海馬組織Apaf-1蛋白

3 討論

缺血性腦血管病是以腦循環(huán)血量下降為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常見病及多發(fā)病，近年來，細(xì)胞凋亡在缺血性腦損傷發(fā)生機(jī)制中的作用逐漸被認(rèn)識(shí)，1990年Shigeno等〔3〕首先提出全腦缺血的神經(jīng)元死亡與凋亡有關(guān)，此后許多研究表明用不同動(dòng)物模型和不同檢測方法所發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡情況不同;不完全性短暫性腦缺血時(shí)，缺血細(xì)胞的早期形態(tài)變化與凋亡的形態(tài)學(xué)特征相一致〔4〕。

細(xì)胞凋亡是多基因嚴(yán)格控制的過程，這些基因主要有Bcl-2家族、caspase家族、癌基因c-Myc、抑癌基因P53等，參與細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路很多，而在腦缺血再灌注損傷過程中，主要是JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，葉冬青等〔5，6〕研究表明，無論是離體培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖后還是在體腦缺血再灌注大鼠海馬神經(jīng)元，都可致JNK3的表達(dá)增加進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。在JNK信號(hào)通路中，由于一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)均以Apaf-1為靶子而調(diào)節(jié)凋亡體，因此Apaf-1被認(rèn)為是凋亡體的核心〔7，8〕。Apaf-1在線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑中是這樣發(fā)揮作用的:絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)是一組分布于胞質(zhì)的進(jìn)化上保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，激活的MAPK通過磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白和其他酶類等蛋白底物來調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生理過程。JNK是MAPK重要成員之一，目前所知JNK包括JNK1、JNK2和JNK3三種亞型，JNK1和JNK2廣泛分布于多種組織，JNK3主要分布于神經(jīng)組織、睪丸及心肌細(xì)胞中。在鈣離子超載、氧自由基等應(yīng)激刺激下，使位于細(xì)胞質(zhì)的JNK3磷酸化而激活JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，磷酸化的JNK3逐漸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，促使高電導(dǎo)非選擇性通道PTP(PTP)開放和線粒體膜電位崩解，細(xì)胞色素C從線粒體內(nèi)膜間隙釋放入胞質(zhì)，在dATP/ATP存在的條件下，細(xì)胞色素C與胞漿中的Apaf-1結(jié)合，改變Apaf-1的構(gòu)象，消除其自身多聚化的作用，使 procaspase-9與Apaf-1結(jié)合，并活化為caspase-9，進(jìn)一步激活下游的效應(yīng)因子 caspase-3、6、7 等，使細(xì)胞走向不可逆凋亡〔9，10〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)胞凋亡在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要的作用，Apaf-1蛋白表達(dá)升高促進(jìn)了神經(jīng)元的凋亡，是腦缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制之一，這可能成為治療該類疾病新的分子靶點(diǎn)，為探索防治該類疾病的藥物開辟了新的研究方向。

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