于曉云 張博愛 李俊敏 劉 宇 李曉曉 崔 璨 崔紅衛(wèi)

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450052)

慢性腦缺血是一種能導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病和嚴(yán)重記憶功能障礙的病理狀態(tài)，阿爾茨海默病、血管性癡呆、缺血性卒中均與此有關(guān)，目前干細胞治療已成為其一個有吸引力的治療策略，最常用的干細胞來源于骨髓，研究證明，骨髓間充質(zhì)干細胞可以通過旁分泌作用分泌腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)等多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，有效治療亨廷頓病和肌萎縮性側(cè)索硬化等神經(jīng)退行性疾病〔1〕。Cdc42是細胞骨架的重要調(diào)節(jié)因子，其活化后可通過激活A(yù)rp2/3介導(dǎo)的肌動蛋白聚合反應(yīng)，引起細胞骨架重構(gòu)，調(diào)節(jié)樹突棘的生長，從而改善慢性腦缺血大鼠的認(rèn)知功能，而骨髓間充質(zhì)干細胞能否調(diào)控Cdc42的表達從而改善認(rèn)知功能目前尚不明確。大鼠永久性雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎(2VO)是模擬慢性腦缺血的主要方式〔2〕，且術(shù)后8～12 w是最接近人類慢性腦缺血后血流改變的階段〔3〕，故我們通過制作2VO模型產(chǎn)生慢性全腦低灌注，用Morris水迷宮篩選出造模成功的大鼠，分別于術(shù)后8、10、12 w檢測大鼠行為學(xué)改變，通過免疫組化和Western印跡檢測海馬區(qū)Cdc42表達的變化。

1 材料與方法

1.1 骨髓間充質(zhì)干細胞提取、培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及注射 體重約150 g SD大鼠頸椎脫臼處死，75%酒精浸泡5 min，分離大鼠后肢股骨、脛骨，超凈工作臺內(nèi)剪開暴露骨髓腔并用全培養(yǎng)基反復(fù)沖洗，沖洗液移至離心管內(nèi)，1 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀細胞于DMEM-F12(10%FBS)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，密度為1×106個細胞，置于5%CO2、37℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，2～3 d更換培養(yǎng)基1次。待貼壁細胞接近90%時，將細胞懸液1∶3傳代。大鼠造模1 w時取P5代細胞，從尾靜脈注射1 ml骨髓間充質(zhì)干細胞單細胞懸液入老鼠體內(nèi)(按細胞密度2×106個/ml)。取部分P5代骨髓間充質(zhì)干細胞，待細胞長至滿瓶底的50%時更換含有攜帶綠色熒光蛋白(GFP)基因的慢病毒培養(yǎng)液，感染復(fù)數(shù)(MOI)為30，至細胞長滿瓶底，按上述濃度從尾靜脈移植入體內(nèi)。

1.2 實驗動物及分組 購健康雄性SD大鼠(鄭州大學(xué)實驗動物中心)72只，體重450～550 g，隨機分為假手術(shù)組、2VO模型組、實驗組(2VO模型+干細胞移植組)，各組分8、10、12 w三個時間點，每個時間點8只。

1.3 動物模型的制備 采取2VO制造大鼠慢性腦缺血模型〔4〕，術(shù)前禁食12 h，禁水4 h，給予10%水合氯醛腹腔注射(0.3 ml/100 g)，仰臥位固定，頸部剪毛、消毒，取正中切口，逐步剝離出雙側(cè)頸總動脈，先后給予近心端和遠心端結(jié)扎，于兩結(jié)扎點之間剪斷頸總動脈以確保血流中斷，逐層縫合。假手術(shù)組除不結(jié)扎頸總動脈外其他操作均與模型組相同。

1.4 Morris水迷宮測試 Morris水迷宮可用于測試大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能，分為隱蔽站臺實驗和空間探索實驗兩部分。每天訓(xùn)練開始時將鼠任意從四個象限之一面向池壁放入水中，每次試驗鼠共游90 s尋找站臺，若成功找到，給予30 s休息時間，若未找到，引導(dǎo)至站臺，同樣給予30 s休息時間，共訓(xùn)練4 d，每天上午2次，下午2次。隱蔽站臺實驗結(jié)束24 h后撤除平臺，將鼠從一固定象限入水，由圖像自動監(jiān)視和處理系統(tǒng)記錄大鼠的逃避潛伏期。訓(xùn)練后即手術(shù)取腦。

1.5 腦組織切片的制備及Cdc42的免疫組織化學(xué)的檢測 各組大鼠達到規(guī)定時間點后，10%水合氯醛麻醉，仰臥位固定備皮，剪開胸部皮膚暴露心臟，在左心耳處刺一小口引流血液，在主動脈弓插一針頭灌注4%多聚甲醛，直至大鼠后肢繃直，尾部豎起成一直線，開顱取腦，將其放入4%多聚甲醛中過夜，石蠟包埋后4 mm連續(xù)切片，取海馬區(qū)觀察。采用山羊超敏二步法行免疫組化檢測，依次烤片、脫蠟水化、0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液95℃水浴15 min，H2O2室溫避光封閉10 min，一抗(sc-6083美國Santa Cruz公司)以1∶75濃度4℃過夜，生物素二抗(PV-9003北京中杉金橋)室溫孵育20 min，DAB(北京中杉金橋)顯色，鏡下控制反應(yīng)時間，蘇木素復(fù)染后鹽酸酒精分化，脫水透明、中性樹膠封片。用PBS液代替一抗設(shè)立陰性對照。用倒置顯微鏡觀察Cdc42的陽性細胞數(shù)并計數(shù)，在400倍視野下計數(shù)5個不重復(fù)視野中的陽性細胞個數(shù)，取平均值。

1.6 Cdc42蛋白樣品的制備及Western印跡檢測 各組大鼠達到規(guī)定的時間點后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，俯臥位固定，快速開顱取腦，于冰上解剖取出海馬，小組織剪剪碎，以1 ml/100 mg加組織裂解液RIPA(R0010北京索寶萊科技公司)，冰上研磨30 min，12 000 r/min 4℃離心，取上清，加上樣緩沖液100℃變性10 min，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

Western印跡檢測:用聚丙烯酰胺電泳獲得Cdc42蛋白，濃縮膠6%，電壓80 V，分離膠12%，電壓100 V，半干轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉，一抗1∶500過夜，二抗(IH-0051北京鼎國昌盛)1∶1 000，ECL(CW-0049北京康為世紀(jì))顯色，暗室曝光，定影、顯影。以β-actin(CW-0096北京北京康為世紀(jì))作為內(nèi)參對照，掃描膠片后以目的蛋白的灰度值與內(nèi)參的灰度值比值進行統(tǒng)計分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，檢測數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性，用單因素方差分析和兩兩比較t檢驗，所有的結(jié)果用x±s表示。

2 結(jié)果

2.1 骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及移植結(jié)果 見圖1。

圖1 骨髓間充質(zhì)干細胞

2.2 水迷宮測試結(jié)果 如表1所示，假手術(shù)組大鼠潛伏期無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，隨時間的延長模型組和實驗組大鼠潛伏期均逐漸延長(P＜0.05)，相同時間點，實驗組大鼠較模型組大鼠潛伏期縮短(P＜0.05)。

2.3 免疫組織化學(xué)測試結(jié)果 DAB染色結(jié)果如圖2所示:假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量豐富，三個時間點無明顯差異(P＞0.05)，模型組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元變性壞死、數(shù)量缺失明顯增多，且隨著時間延長程度逐漸加重(P＜0.05)，實驗組海馬區(qū)神經(jīng)元變性壞死、細胞缺失程度較模型組明顯減輕(P＜0.05)，隨時間延長細胞缺失程度逐漸加重(P＜0.05)。見表2。

2.4 Western印跡測試結(jié)果 如圖3所示:假手術(shù)組Cdc42蛋白表達無明顯差異，模型組蛋白表達明顯減少，且隨時間延長逐漸降低，實驗組蛋白表達較模型組增高，與水迷宮及免疫組化結(jié)果一致。見表3。

表1 大鼠在水迷宮試驗中的平均逃避潛伏期(x ± s，n=8)

表2 大鼠海馬CA1區(qū)陽性細胞數(shù)(x ± s，n=8)

表3 各組大鼠海馬Cdc42蛋白Western印跡相對灰度值(x ±s，%，n=8)

圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)Cdc42的表達(DAB，×400)

圖3 海馬區(qū)蛋白Cdc42的Western印跡檢測結(jié)果

3 討論

慢性腦缺血是引起認(rèn)知功能障礙最常見的原因之一，在2VO慢性腦缺血模型中，腦組織通過一系列損傷級聯(lián)反應(yīng)引起神經(jīng)元及神經(jīng)突觸的進行性減少。神經(jīng)突觸，尤其是興奮性突觸是認(rèn)知功能的基礎(chǔ)，大多數(shù)興奮性突觸位于神經(jīng)元樹突棘(樹突表面的小突起)的尖端。大腦海馬區(qū)在維持認(rèn)知及記憶功能中起著至關(guān)重要的作用，2VO模型中，海馬區(qū)神經(jīng)元減少尤為嚴(yán)重，從而影響大鼠學(xué)習(xí)和記憶功能〔5〕。Cdc42是Ras超家族中小分子量G蛋白成員之一，具有GTP酶活性，在大鼠的海馬、小腦、丘腦、大腦皮層均有表達〔6，7〕，Cdc42 被激活后可調(diào)控神經(jīng)元的形態(tài)和極化活動，包括細胞的分裂、遷移，軸突發(fā)芽、生長和伸長率，以及再生和突觸可塑性〔8〕，其調(diào)控路徑是多樣的，例如:與GTP結(jié)合的Cdc42可通過與WASP及其亞型的相互作用參與調(diào)節(jié)肌動蛋白的聚合和絲狀偽足的形成〔9〕，活化的Cdc42可聯(lián)合活化的PAKs通過絲氨酸/蘇氨酸激酶LIMK1途徑改變細胞骨架〔10〕，其通過PAR蛋白家族調(diào)節(jié)小鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)結(jié)構(gòu)的形成及細胞分化、星形膠質(zhì)細胞突觸生長方向〔11，12〕。通過以上途徑均可調(diào)控海馬神經(jīng)元樹突棘的生長，進而改善大鼠的記憶及認(rèn)知功能。

間充質(zhì)干細胞是中胚層細胞的基質(zhì)前體細胞，可從幾乎所有結(jié)締組織中分離，具有易于獲取、來源豐富、沒有明顯移植排斥反應(yīng)等優(yōu)點，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中具有巨大應(yīng)用前景。本實驗通過觀察骨髓間充質(zhì)干細胞移植后慢性腦缺血大鼠海馬區(qū)Cdc42的變化，發(fā)現(xiàn)隨著時間的延長，大鼠海馬區(qū)Cdc42表達逐漸減少，空間認(rèn)知功能逐漸下降，而干細胞移植組大鼠Cdc42的表達均比相對應(yīng)時間點2VO模型組多，且大鼠認(rèn)知功能均有改善，說明骨髓間充質(zhì)干細胞移植后可通過某種途徑提高Cdc42的表達，調(diào)控樹突棘的生長，進而改善神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、損傷后修復(fù)、學(xué)習(xí)、記憶等多種功能。我們推測，干細胞移植后可通過旁分泌途徑分泌BDNF等多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，通過其 TrkB 受體，磷酸化 Ephrin-B，進而活化 EphB2〔13〕，EphB2 活化Cdc42后，通過上述途徑調(diào)控樹突棘的生長，改善慢性腦缺血大鼠的認(rèn)知功能障礙。

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