邸 軍 李梓菲 陳 艷 高 丹 張 蕾

(吉林省人民醫(yī)院病理科，吉林 長春 130021)

長期供氧供能不足會導(dǎo)致心肌細(xì)胞(MC)損傷及死亡，從而造成MC數(shù)量減少，進(jìn)一步導(dǎo)致疤痕組織形成和心室重構(gòu)，引起心臟功能受損甚至危害生命。目前的研究普遍認(rèn)同MC是終末分化期永久細(xì)胞，不具有自我增殖的能力，受到損傷后細(xì)胞無法通過自身的增殖代替死亡細(xì)胞達(dá)到修復(fù)心肌的目的。近些年來細(xì)胞療法即利用細(xì)胞移植替代器官組織中損傷或死亡細(xì)胞的方法已經(jīng)成為目前醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的一個重點(diǎn)研究方向。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的自我更新能力和多分化潛能使其成為細(xì)胞療法的重要種子細(xì)胞〔1，2〕。BMSCs在適當(dāng)?shù)臈l件下可以誘導(dǎo)分化為多種類型的細(xì)胞〔3～5〕。目前已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)證明BMSCs可以在一定誘導(dǎo)條件下分化為MC，但是其具體機(jī)制并未完全闡明。本實(shí)驗(yàn)試圖闡明其分化機(jī)制，為BMSCs在心血管疾病的治療應(yīng)用上探索新的方法。

1 材料與方法

1.1 BMSCs的分離培養(yǎng)及體外擴(kuò)增 無菌條件下分離大鼠乳鼠雙下肢股骨，應(yīng)用PBS沖洗多次。將含10%FBS的L-DMEM完全培養(yǎng)基吸入含有肝素的注射器內(nèi)，沖洗骨髓腔3～4次。將沖洗獲得的細(xì)胞懸液加入到含10%胎牛血清的L-DMEM完全培養(yǎng)液內(nèi)，1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞數(shù)，以1×106cells/ml密度接種于培養(yǎng)瓶中，置37℃ 含有5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，每3 d全量換液1次。待貼壁細(xì)胞生長達(dá)到80% ～90%融合后，應(yīng)用0.25%胰酶與1 mmol的EDTA消化液消化，按1∶3比例傳代。

1.2 BMSCs的表型鑒定 應(yīng)用0.25%胰酶與1 mmol的EDTA消化并收集細(xì)胞，將抗CD44、CD45、CD105抗體(Neomarker，USA)與細(xì)胞常溫下孵育30～40 min。PBS洗滌2次后，加入FITC熒光標(biāo)記的二抗，4℃避光孵育。20～30 min后PBS沖洗2次，加500μl PBS重懸細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光檢測與分析。對照組為未加一抗的細(xì)胞。

1.3 BMSC多向分化能力鑒定 取生長狀態(tài)良好的P5代BMSC，以1×104/孔細(xì)胞數(shù)加入到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長到80%～90%融合后，分別加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基與成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)14 d后，采用細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色判定大鼠BMSC向成脂分化的能力，誘導(dǎo)21 d后，采用茜素紅染色判定大鼠BMSC向成骨方向誘導(dǎo)的能力。

1.4 BMSCs向心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及鑒定 選擇生長狀態(tài)良好的P5代BMSCs，以1×105/孔細(xì)胞數(shù)接種于置有蓋玻片的24孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到60% ～70%時，加入5-氮雜胞苷(5-Aza，USA)，其終濃度為10μmol/L，37℃孵育24 h后換成不含誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。對照組不加5-Aza誘導(dǎo)劑。將含有誘導(dǎo)后的BMSCs細(xì)胞的載玻片水化10 min，加入阻斷劑孵育30 min后PBS沖洗3次，滴加血清封閉30 min，接著滴加抗TroponineI(Neomarker，USA)一抗 20 μl，4℃ 過夜，PBS 沖洗 3次，滴加生物素標(biāo)記的二抗，37℃作用30 min，PBS沖洗3次，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素，37℃作用30 min，PBS沖洗3次，加入DAB顯色，蘇木精復(fù)染核，酒精系列脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1.5 RT-PCR檢測RhoA基因表達(dá) 消化并收集5-Aza誘導(dǎo)前后的細(xì)胞，應(yīng)用RNA提取純化試劑盒按照說明書步驟提取細(xì)胞總RNA。應(yīng)用一步法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以及PCR反應(yīng)，分別取兩組提取的RNA 500 ng，每組內(nèi)分別加入RhoA基因上下游引物1μl，內(nèi)參照 β-actin上下游引物各0.5μl以及PCR反應(yīng)液，總體積為20μl。按照以下條件進(jìn)行RT-PCR反應(yīng):50℃ 50 min RT反應(yīng)，94℃ 2 min滅活 RTase，94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s延伸，循環(huán) 40 次。PCR 產(chǎn)物應(yīng)用1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，拍照。引物序列:β-actin上游:5'-TGTATGCCTCTGGTCGTACC-3'，下游:5'-CAACGTCACACTTCATGATGG-3'，PCR產(chǎn)物片段417 bp;RhoA上游:5'-GTGATTGTTGGTGATGGAGC-3'，下游:5'-CTCGTGGCCATCTCAAAAAC-3'，PCR 產(chǎn)物片段 503 bp。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察 接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)的細(xì)胞在3～4 d后逐漸出現(xiàn)貼壁細(xì)胞，殘留的各種類型的血細(xì)胞通過完全換液在6 d后逐漸被除去。貼壁細(xì)胞呈長梭形，為單個或幾個細(xì)胞的克隆，細(xì)胞形態(tài)均一 。培養(yǎng)至10～18 d后，細(xì)胞生長達(dá)到80%～90%的融合，細(xì)胞克隆表達(dá)并相互重疊，但無接觸抑制現(xiàn)象。傳代后的BMSCs形態(tài)均一，生長旺盛，成纖維細(xì)胞樣緊密排列，細(xì)胞間界限不清。見圖1。

2.2 BMSC多向分化能力鑒定結(jié)果 BMSCs成脂誘導(dǎo)14 d后油紅O染色顯示細(xì)胞內(nèi)有染成紅色的脂滴，并伴有脂肪空泡(圖1B)。BMSCs成骨誘導(dǎo)21 d后茜素紅染色顯示細(xì)胞有鈣化結(jié)節(jié)形成，為紅色的致密結(jié)節(jié)(圖1C)。

2.3 BMSCs免疫表型鑒定 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，培養(yǎng)的BMSCs細(xì)胞表面表達(dá)CD44與CD105，細(xì)胞表達(dá)率為95%以上，而細(xì)胞基本不表達(dá)CD45，說明培養(yǎng)的細(xì)胞為間質(zhì)來源。

2.4 BMSCs向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的形態(tài)學(xué)觀察及鑒定結(jié)果BMSCs經(jīng)10μmol/L 5-Aza定向誘導(dǎo)24 h后，細(xì)胞形態(tài)變得不規(guī)則，部分細(xì)胞逐漸變長，2 w后細(xì)胞逐漸由長梭形變?yōu)槎嘟切渭靶切?，類似心肌?xì)胞，TroponineI蛋白免疫組化檢測結(jié)果顯示向心肌方向誘導(dǎo)的BMSCs表達(dá)心肌細(xì)胞特異性TroponineI蛋白。見圖2。

2.5 RhoA基因RT-PCR檢測結(jié)果 BMSCs沒有檢測到RhoA基因表達(dá)，而誘導(dǎo)后的BMSCs檢測到RhoA基因表達(dá)。見圖3。

圖1 培養(yǎng)第5代的BMSCs及分化潛能

圖2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色示TroponineI表達(dá)

圖3 RT-PCR檢測RhoA基因

3 討論

BMSCs作為細(xì)胞移植治療的重要來源細(xì)胞，具有取材方便，無倫理及移植免疫排斥等問題、該細(xì)胞體外容易培養(yǎng)以及大量擴(kuò)增，同時容易定向誘導(dǎo)分化。目前，通過BMSCs誘導(dǎo)分化獲得心肌樣細(xì)胞的技術(shù)還不成熟。有研究結(jié)果顯示BMSCs應(yīng)用5-Aza誘導(dǎo)分化后，能夠形成心肌肌管樣結(jié)構(gòu)，并表達(dá)MC特異性表面抗原標(biāo)記。因此說明BMSCs具有向心肌樣細(xì)胞分化的潛能，為BMSCs用于MC損傷后的修復(fù)提供了理論上的依據(jù)〔6〕。5-Aza現(xiàn)已成為誘導(dǎo)BMSCs向MC分化的常用誘導(dǎo)劑，但其原理尚未完全闡明，其機(jī)制可能是5-Aza控制干細(xì)胞向MC分化的相關(guān)DNA的去甲基化，啟動相關(guān)促進(jìn)干細(xì)胞向MC分化的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。

本研究顯示培養(yǎng)獲得的BMSCs形態(tài)以及表面標(biāo)志物符合間充質(zhì)干細(xì)胞特點(diǎn)。說明本實(shí)驗(yàn)獲取的細(xì)胞是純度較高的大鼠BMSCs，而且BMSCs已經(jīng)成功向MC分化。

有研究顯示Rho/ROCK信號途徑在5-Aza促進(jìn)BMSCs向MC分化的過程中發(fā)揮重要作用。RhoA是細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)抑制信號、參與信號級聯(lián)放大過程中及調(diào)控細(xì)胞支架動力學(xué)的關(guān)鍵物質(zhì)。ROCK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞內(nèi)參與細(xì)胞骨架動力學(xué)與DNA表達(dá)調(diào)控〔7〕。Rho調(diào)節(jié)ROCK活性，細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時ROCK不具備酶活性，當(dāng)Rho傳遞活化信號后，ROCK發(fā)生磷酸化并被激活，使肌球蛋白磷酸酶發(fā)生磷酸化并失去活性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)肌球蛋白輕鏈脫磷酸化，引起肌動蛋白微絲骨架的聚合〔8〕。5-Aza能夠通過來誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化。在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，在BMSCs向心肌細(xì)胞分化過程中表達(dá)RhoA。因此，5-Aza促進(jìn)BMSCs向MC分化可能是通過Rho/ROCK信號途徑來調(diào)控的。

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