鐘 飛 周衛(wèi)華 石慧娟 張 潔

(吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 吉首 416000)

心肌細(xì)胞凋亡是在一定生理和病理?xiàng)l件下，通過特殊信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活細(xì)胞“自殺”程序，在基因調(diào)控下進(jìn)行的程序化死亡。目前認(rèn)為心肌細(xì)胞凋亡是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，在心肌病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用〔1〕。死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白(Daxx)是Yang等〔2〕在1997年發(fā)現(xiàn)的一種Fas死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白，可激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;研究顯示，干預(yù)Daxx在心肌中的表達(dá)，可減少大鼠心肌梗死的面積與心肌細(xì)胞的凋亡〔3〕，我們推測(cè)Daxx可能成為調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡新的重要藥理作用靶點(diǎn)，我們以前的研究表明黃芪甲甙具有減少阿霉素性心肌病心肌細(xì)胞凋亡作用，本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討黃芪甲甙調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，為開發(fā)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠40只，SPF級(jí)，體重200～250 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與材料 黃芪甲甙(成都錦泰和醫(yī)藥化學(xué)技術(shù)有限公司)用助溶劑羧甲基纖維素鈉制成所需濃度，DEPC(Sigma公司)，Trizol試劑(Invitrogen公司)，RT-PCR試劑盒(Promega公司)，氯仿(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)，異丙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)，瓊脂糖(Sigma公司)、乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶(CK)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 TGL-16G冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn));723可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司);萊卡切片機(jī)(RM2126);全自動(dòng)生物組織脫水機(jī)(YD-12G);生物組織包埋機(jī)(YD-6L);DYY-Ⅲ穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一廠)，DYCZ水平電泳槽(北京六一廠)，天能1600R凝膠成像分析系統(tǒng)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)方法 大鼠隨機(jī)分為4組，即正常組、模型組、黃芪甲甙高劑量組，黃芪甲甙低劑量組，每組10只。正常組采用生理鹽水0.6 ml腹腔注射，隔日1次，共6次，同時(shí)用1%羧甲基纖維素鈉1 ml，每天1次灌胃。模型組采用阿霉素造?！?〕(2.5 mg/kg，隔日 1次腹腔注射，共 6次，總劑量為15 mg/kg);同時(shí)灌胃給予1%羧甲基纖維素鈉1 ml，每天1次。黃芪甲甙處理組造模方法同模型組，高低劑量組同時(shí)分別灌胃給予黃芪甲甙90 mg/kg和30 mg/kg〔5〕(用1 ml 1%甲基纖維素鈉溶解)，每天1次灌胃，連續(xù)2 w，最后一次阿霉素處理24 h后，用20%烏拉坦4 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，摘取心臟取血，心臟沿左心室中線切為兩半，一半用甲醛固定，石蠟包埋后作病理組織學(xué)檢查。

1.4.2 心肌病理學(xué)檢測(cè) 大鼠心肌10%的甲醛固定24 h，常規(guī)脫水透明，石蠟包埋，切片，片厚5μm，HE染色，200倍光鏡下觀察心肌病理改變，并根據(jù)Kishimoto方法〔6〕計(jì)算心肌病變積分，即每張切片隨機(jī)取5個(gè)高倍視野，計(jì)算每個(gè)視野中炎性細(xì)胞浸潤及壞死區(qū)域面積與整個(gè)視野的面積之比，無病變計(jì)0分，病變面積 ＜25% 計(jì)1分，25% ～ 50%計(jì)2分，50% ～75%計(jì)3分，＞75%計(jì)4分。

1.4.3 血清ALT和AST的活性測(cè)定 最后一次阿霉素處理24 h后，用20%的烏拉坦麻醉大鼠，心臟取血，3 500 r/min離心15 min，取上清，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作，測(cè)定血清CK和LDH活性。

1.4.4 RT-PCR檢測(cè)Daxx表達(dá) 取心肌20 mg剪碎，采用Trizol試劑1 000μl一步法提取心肌總RNA，應(yīng)用UV-3100型紫外光光度計(jì)檢測(cè)樣品吸光度A，A260/A280為1.8～2.0。應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)大鼠心肌組織的Daxx mRNA的表達(dá)。Daxx上游引物:5'-TCCAACCCAGCCTCTAATCC-3'，下游引物:5'-TAGCCCTCCCAGTATCTCGT-3'，β-actin 上 游 引 物:5'-ATGTGCAAAGCCGGCTTC-3'，β-actin 下游引物 5'-GGCTGGGGTGTTGAAGGTCT-3'，反應(yīng)條件為:94℃變性 50 s，58℃ 退火 40s，72℃延伸60 s。反應(yīng)產(chǎn)物用1% 瓊脂糖凝膠電泳(100 V，40 min)，紫外燈下觀察結(jié)果并攝片，用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描，進(jìn)行圖像分析，吸光面積積分比值表示DNA含量，以Daxx與β-actin擴(kuò)增條帶的吸光面積積分比值評(píng)定Daxx mRNA表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有計(jì)量數(shù)據(jù)采用x±s表示，采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間比較用方差分析，兩兩比較用S-N-K法。

2 結(jié)果

2.1 黃芪甲甙對(duì)阿霉素大鼠心肌組織病理的影響 對(duì)照組心肌細(xì)胞排列整齊，胞核清晰，無心肌纖維的破壞，細(xì)胞間隙正常，未見水腫，組織間隙無炎性滲出。模型組心肌細(xì)胞腫脹，排列紊亂，心肌纖維減少，肌原纖維斷裂，多灶性變性和壞死，心肌壞死灶內(nèi)可見單核、淋巴細(xì)胞浸潤。高劑量組和低劑量處理組上述病變明顯減輕，尤以高劑量組最為明顯，心肌細(xì)胞變性壞死顯著減少，肌原纖維排列較整齊，心肌間僅見部分紅細(xì)胞浸潤。高劑量干預(yù)組和低劑量干預(yù)組心肌病理積分明顯低于模型對(duì)照組(P＜0.05)。見圖1和表1。

2.2 心肌生化指標(biāo) 模型組大鼠心肌組織LDH和CK活性升高，與正常組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);灌胃給予高低不同劑量黃芪甲甙后，大鼠心肌組織LDH和CK活性下降，與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

2.3 RT-PCR檢測(cè)Daxx表達(dá) 與正常組相比，模型組大鼠心肌組織Daxx mRNA增加至正常水平的(1.65±0.22)倍(P＜0.01)，黃芪甲甙低劑量和高劑量灌胃給藥后大鼠心肌組織中daxx的表達(dá)分別為正常水平的(1.19±0.10)和(1.48±0.12)倍，與模型組相比顯著性差異(P＜0.05)。見圖2。

圖1 黃芪甲甙對(duì)阿霉素大鼠心肌組織病理的影響(HE染色，×400)

表1 黃芪甲甙對(duì)大鼠心肌組織病理積分，LDH和CK活性的影響(x ± s，n=10)

圖2 心肌組織中Daxx表達(dá)水平的變化

3 討論

普遍認(rèn)為阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷與過量氧自由基的產(chǎn)生有關(guān)〔7〕，它導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜的直接損害〔7〕，導(dǎo)致CK和LDH的含量升高。黃芪甲甙為中藥黃芪的重要的活性成分，研究表明其對(duì)病毒性心肌炎具有良好的治療效果，能改善病毒性心肌病大鼠心功能、減輕心肌病理改變〔8，9〕。我們以前的研究證實(shí)黃芪甲甙可以顯著減少阿霉素所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡〔10〕。本實(shí)驗(yàn)病理結(jié)果分析表明黃芪甲甙可顯著減輕阿霉素心肌病大鼠的心肌病理損害，降低其血清CK和LDH活性，保護(hù)心肌細(xì)胞，從而治療阿霉素心肌病。

近年來的研究證實(shí)ADR導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡在其對(duì)心肌的毒性損傷機(jī)制中起重要的作用〔10〕。Fas為死亡受體，屬于腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族成員。FasL為死亡因子，是Fas的天然配體，當(dāng)表達(dá)Fas的靶細(xì)胞和活性細(xì)胞的FasL交聯(lián)后，啟動(dòng)凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑，從而激活Fas/FasL途徑下游的ICE相關(guān)蛋白酶系列，引起核酸內(nèi)切酶活化，降解DNA修復(fù)酶及細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白，最終導(dǎo)致Fas表達(dá)陽性的靶細(xì)胞凋亡〔11〕。Fas/FasL系統(tǒng)介導(dǎo)的凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑是許多心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制〔12〕。研究首先證實(shí)Daxx在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，H2O2處理細(xì)胞能誘導(dǎo)Daxx表達(dá)上調(diào)，而用反義寡核苷酸抑制Daxx的表達(dá)能抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Yaniv等〔13〕研究進(jìn)一步探明了Daxx誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，首先H2O2激活Fas，F(xiàn)as的死亡結(jié)構(gòu)域 DD區(qū)可與Daxx的C末端一個(gè)功能區(qū)結(jié)合，通過激活JNK途徑而啟動(dòng)凋亡的發(fā)生。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Daxx在阿霉素心肌病大鼠心肌中表達(dá)升高，表明Daxx可能通過Fas-Daxx-JNK介導(dǎo)了阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

綜上所述Daxx在阿霉素心肌病大鼠心肌中表達(dá)上調(diào)，并在阿霉素心肌病的發(fā)生發(fā)展中起一定的作用，黃芪甲甙能下調(diào)Daxx的表達(dá)，減輕病理損害，其機(jī)制可能與抑制細(xì)胞凋亡等保護(hù)心肌細(xì)胞等作用有關(guān)。

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