葉素紅 陳衛(wèi)松 王曉蓉

(浙江大學金華醫(yī)院神經(jīng)內科，浙江 金華 321000)

急性缺血性腦卒中在臨床上非常常見，具有高發(fā)病率、高致死率、高致殘率，已成為威脅人類健康的主要疾病之一。目前對缺血性腦卒中的腦保護研究日益受到重視，其中星形膠質細胞(AS)腦保護作用的研究一直倍受關注。膠質纖維酸性蛋白(GFAP)是AS胞漿內一種重要的骨架蛋白，是AS特征性標志蛋白〔1〕。GFAP在AS受到刺激引起反應時表達發(fā)生變化，因此可用GFAP特異性地標記AS，被認為是AS活化的標志。本研究擬探討甘露醇對缺血性腦損傷后AS活動的影響。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑 健康雄性SD大鼠，體重240～280 g，SPF級，每籠6～8只群養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為自由攝食、飲水，12 h光照。環(huán)境溫度18℃ ～20℃，相對濕度50% ～70%。試劑:10%水合氯醛，乙醚，肝素鈉;碘伏，75%酒精，0.9%生理鹽水;20%甘露醇(250 ml/袋)，注射用無菌用水;4%多聚甲醛，多聚賴氨酸;兔抗GFAP，生物素標記山羊抗兔IgG，鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物(SABC)，3，3'-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 分組 按體重編號，采取讀取隨機數(shù)的方法將大鼠隨機分成0劑量組、小劑量組、中劑量組、大劑量組，以1∶2∶2∶2的比例分配，所有大鼠都建立缺血再灌注模型，最后每組6只大鼠入組。

1.2.2 大鼠大腦中動脈阻塞(MCAO)再灌注模型制作 稱重后經(jīng)腹腔按0.35 ml/100 g〔2〕注射水合氯醛麻醉，約6～10 min麻醉至仰臥不能自己翻正。固定大鼠，消毒、鋪無菌洞巾。完全暴露頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)。ECA的分支枕動脈不必結扎，不分離出ICA的第一個分支PPA〔3〕。ICA遠端用微動脈夾夾閉;距CCA分叉2～3 mm處將CCA剪一小口，插入栓線，栓線進入ICA，輕柔推進，插入深度距分叉處約(18.2±0.5)mm〔4〕。此時栓線頭端正好位于大腦前動脈(MCA)起始部，栓線側壁即對MCA造成阻斷，造成單側MCAO模型。結扎血管、固定好尼龍線，將線頭埋入皮下，縫合皮膚。栓線堵塞后開始計時，2 h后用乙醚快速麻醉。輕柔拔出栓線約10 mm，在結扎線附近剪斷，縫合皮膚，制成缺血再灌注模型。

1.2.3 給藥 從大鼠建立缺血再灌注模型開始，通過大鼠尾靜脈用微泵緩慢注射甘露醇到大鼠體內，6 h注射一次。采用小(10 ml/kg)、中(15 ml/kg)、大(20 ml/kg)〔5〕三個不同的劑量對模型組大鼠用藥，0劑量組注射等量的無菌注射用水。

1.2.4 評分標準 麻醉蘇醒后即觀察大鼠:①神經(jīng)行為學表現(xiàn)，并參考Longa等〔6〕的5級4分法標準進行評分:0分:無神經(jīng)功能缺損癥狀;1分:提尾不能伸展對側前爪;2分:行走向對側轉圈;3分:行走困難，并向對側傾倒;4分:不能自發(fā)行走，意識障礙。②HE染色:將存活24 h或72 h的大鼠麻醉斷頭取腦，浸于4%多聚甲醛24 h，取出并切片做HE染色。造模成功率部分參考沈斌等〔7〕制定的標準:以至少存活24 h、評分1～3分、HE染色可見明顯缺血灶為造模成功標準。

1.2.5 結果觀察 固定兩個人對所有入組的每只大鼠在四個時間點(再灌注后0 h、24 h、48 h、72 h)進行 mNSS 評分;在72 h后斷頭取腦，約平對耳線前方5.4 mm的平面切斷大鼠腦，切取該切面前后3 mm的兩塊腦組織制作石蠟切塊，制作免疫組化切片。10×20倍顯微鏡下觀察缺血周邊GFAP陽性細胞數(shù)目，每個區(qū)域隨機選擇三個相鄰視野計算平均值。

1.3 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，含一個重復測量因素的兩因素定量資料用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析，單因素多水平的定量資料用單因素方差分析，兩兩水平之間的比較用Tukey法或LSD法，兩變量間的相關關系采用Pearson相關分析，所有數(shù)據(jù)均由SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理。

2 結果

2.1 模型組大鼠不同劑量甘露醇再灌注后不同時點神經(jīng)功能缺損表現(xiàn) 0劑量組的mNSS評分值和小、中、大劑量組的差別均有統(tǒng)計學意義，P=0.023、0.026、0.019，而不同劑量對 mNSS值的影響差異無統(tǒng)計學意義(P=0.972)。見表1。

2.2 模型組大鼠應用不同劑量甘露醇3 d(72 h)后的缺血周邊區(qū)GFAP陽性細胞數(shù)目的變化 不同劑量組缺血周邊GFAP數(shù)目不完全相同，0、小、中、大劑量組GFAP數(shù)目分別為15.79±3.21、22.19±2.98、25.30±2.16、24.62±3.83，Tukey HSD 法多重比較結果:0劑量分別和小、中、大劑量組比較差別有統(tǒng)計學意義，P=0.010、0.008、0.004，LSD 法的結果亦類似。而小、中、大劑量組間經(jīng)Student-Newman-Keuls法和Tukey HSD法檢驗，P=0.812、0.896。表明三個不同劑量組間缺血周邊GFAP數(shù)目差異無統(tǒng)計學意義。

2.3 24只大鼠缺血再灌注72 h的mNSS和其對應的再灌注72 h后的缺血周邊的GFAP陽性細胞數(shù)目直線相關分析 兩組數(shù)據(jù)Pearson相關系數(shù)為－0.828(P=0.005)，表明兩者具有負相關性。

表1 模型組大鼠使用不同劑量甘露醇后mNSS比較(x ±s，n=6)

3 討論

缺血性腦血管疾病是人類最常見的腦血管病之一，其中MCA是其好發(fā)部位，約占60%以上。大鼠腦血管與人類相似，故認為大鼠是建立腦缺血模型的最佳動物。甘露醇對缺血性腦損傷后AS活動影響的研究鮮有報道，故本實驗選擇了甘露醇這個實驗因素，觀察較常用的甘露醇對急性缺血性腦損傷后AS反應性活動的影響。同時考慮到甘露醇脫水降顱壓作用有可能改善mNSS評分，本實驗采用持續(xù)靜脈緩慢滴注的方法，使其脫水、降顱壓作用不明顯，減少該方面的影響。

本實驗結果表明，在急性缺血性腦損傷后用甘露醇，均有隨再灌注后時間增加而mNSS評分值變小的趨勢，但未用甘露醇組的評分值下降的幅度明顯比用了甘露醇的三組(小、中、大劑量組)小，由此可知應用甘露醇比未用者可以明顯改善缺血再灌注后的mNSS值，而小、中、大劑量組間對降低再灌注后mNSS值幅度的差別不明顯，可認為在一定程度上所用甘露醇的劑量對改善大鼠神經(jīng)功能缺損狀況無明顯影響。在再灌注后72 h，四個劑量組間缺血周邊的GFAP陽性細胞數(shù)目有明顯差別，未用甘露醇組(0劑量組)GFAP陽性細胞數(shù)目明顯小于小、中、大劑量組，而后三組間未見明顯差別，由此可認為，應用甘露醇后可以明顯增加缺血再灌注后GFAP陽性細胞數(shù)目，而一定程度上尚未發(fā)現(xiàn)所用甘露醇的劑量對增加GFAP陽性細胞數(shù)目有明顯影響。由于不同劑量甘露醇改善mNSS值及增加缺血周邊GFAP陽性細胞數(shù)目的趨勢類似，所以對再灌注后72 h的各組mNSS值和再灌注后72 h相應各組的缺血周邊GFAP陽性細胞數(shù)目進行Pearson相關分析，發(fā)現(xiàn)評分值和缺血周邊GFAP陽性細胞間均具有負相關性。缺血周邊GFAP陽性細胞數(shù)目越多，大鼠mNSS值越小。故有理由推測AS數(shù)目增多可能是改善mNSS值的主要原因之一，可能有腦保護的作用，通過使缺血周邊AS反應性增生，改善大鼠mNSS值是其可能的機制之一。但本實驗的不足之處在于:AS數(shù)目增多即反應性活動加強對腦組織具有利弊兩面性，急性腦損傷后缺血周邊AS反應性活動在何時利大于弊或何時弊大于利尚不清楚。故對界定急性腦損傷后缺血周邊AS反應性活動發(fā)揮腦保護和腦損傷作用的時間段，值得進一步深入研究。

1 Dietrich WD，Truetter J，Zhao W，et al.Sequential changes in glial fibrillary acidic protein and expression following parasagittal fluid-percussion brain injury in rats〔J〕.Neurotrauma，2005;16:567-81.

2 高善榮，杜聞偉，曾 麗，等.不同廠家葛根素注射劑防治實驗性大鼠腦損傷的比較研究〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2005;(5):31-2.

3 吳 瑩，陳文榮，吳春澤，等.栓線法大鼠局灶性腦缺血模型的建立與改進〔J〕.汕頭大學醫(yī)學院學報，1999;12(1):23-5.

4 Carcia TH.A reliable method to occlued a middle cerebral artery in Wistar rats〔J〕.Stroke，1993;24(9):1423.

5 趙振偉，曲友直，高國棟，等.甘露醇與尼莫通聯(lián)合應用對大鼠腦缺血再灌注損傷保護機制的研究〔J〕.Clin Neurol June，2005;18(3):204-6.

6 Longa EZ，Weinsten PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke，1989;20(1):84-91.

7 沈 斌，XuHaoliang.線栓法制備SD大鼠局灶性腦缺血/再灌注模型的改良研究〔J〕.首都醫(yī)科大學學報，2007;28(6):782-4.