韓 濤 王一丹 吳國(guó)泰 史玉攀 郭 倩

(甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

近年來(lái)，文獻(xiàn)報(bào)道中藥復(fù)方、單味中藥和中藥有效成分抗肝纖維化取得諸多研究進(jìn)展〔1，2〕。黃芪具有補(bǔ)中益氣之功，在臨床上常用于治療慢性肝病。歷代本草中紅芪記載于黃芪項(xiàng)下，列為上品〔3，4〕，與黃芪的功效相似，多糖為紅芪主要成分之一。本實(shí)驗(yàn)研究紅芪多糖抗大鼠肝纖維化的藥效作用。

1 材料與方法

1.1 藥品 紅芪多糖、黃芪多糖、紅芪水煎液，均由甘肅中醫(yī)學(xué)院藥化實(shí)驗(yàn)室提供。二甲基亞硝胺(DMN)，購(gòu)自天津市化學(xué)試劑研究所，批號(hào):20110308。大鼠 ALT、AST、HA、LN、Hyp、PCⅢ、Ⅳ-C ELISA試劑盒，均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)。生理鹽水，購(gòu)自四川科倫藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào):C11022108-1。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 多功能時(shí)間分辨熒光免疫分析系統(tǒng)，芬蘭wallacVICTOR2 1420研制。80-1型離心機(jī)，上海手術(shù)器械廠(chǎng)生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠，雌雄兼用，體重為(200±20)g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(甘)2004-0006。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組 Wistar大鼠70只，雌雄各半，隨機(jī)分為7組:正常組(A組)、模型組(B組)、紅芪多糖高劑量組(C組)、中劑量組(D組)、低劑量組(E組)、黃芪多糖組(F組)、紅芪水煎液組(G組)，每組10只。

1.4.2 肝纖維化模型 按文獻(xiàn)方法〔5〕，用生理鹽水將DMN稀釋至濃度為0.5%，除正常組外，其余各組大鼠腹腔注射DMN稀釋液1 ml/kg，1 w連續(xù)3 d，1次/d，正常組腹腔注射等劑量生理鹽水，共3 w。

1.4.3 動(dòng)物給藥 用紅芪多糖10 ml/kg(60、30、15 mg/ml)分別對(duì)高、中、低劑量組灌胃給藥，黃芪多糖組灌胃給藥10 ml/kg(30 mg/ml)，紅芪水煎液組灌胃給藥10 ml/kg(0.27 g/ml)，正常組、模型組以等劑量生理鹽水灌胃，1次/d，共4 w。每3天稱(chēng)1次大鼠體重，按照大鼠體重增加相應(yīng)的增加給藥量。

1.4.4 標(biāo)本采集 末次給藥后禁食12 h，各組大鼠股動(dòng)脈取血4 ml，放置2 h，3 000 r/min離心10 min，取上清液待測(cè)血清生化指標(biāo)。立即脫頸椎處死大鼠，剖腹取肝臟觀(guān)察大體外觀(guān)后，取肝右葉相同部位0.5 g放入10%多聚甲醛中，HE和Masson染色，取剩余肝臟0.5 g制備10%肝組織勻漿，3 000 r/min，－20℃保存待測(cè)。

1.4.5 指標(biāo)檢測(cè) ELISA法測(cè)定血清ALT、AST，肝組織HA、LN、Hyp、PCⅢ、Ⅳ-C。HE、Masson 染色觀(guān)察肝組織變化，檢測(cè)膠原纖維面積百分比(膠原纖維占整屏視野的百分比)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量數(shù)據(jù)以x±s表示。采用SPSS14.0軟件統(tǒng)計(jì)運(yùn)算，進(jìn)行單因素方差分析，并用LSD程序進(jìn)行組間差異分析。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 DMN染毒期間觀(guān)察可見(jiàn)，大鼠生長(zhǎng)減慢，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)減少，飲食減少，糞便稀薄，皮毛皺而不潔，缺乏光澤。給藥治療期，紅芪多糖各組、黃芪多糖組、紅芪水煎液組各項(xiàng)生理體征恢復(fù)較快，其中紅芪多糖高劑量組各項(xiàng)體征恢復(fù)尤為明顯。

2.2 血清ALT、AST含量變化 肝纖維化模型組血清ALT、AST含量明顯升高(P＜0.01)。給藥干預(yù)后，與模型組相比，紅芪多糖各組、黃芪多糖組、紅芪水煎液組血清ALT、AST含量均明顯降低(P＜0.01，P＜0.05)。紅芪多糖中劑量組與黃芪多糖組、紅芪多糖低劑量組與紅芪水煎液組比較均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清ALT、AST含量比較(x ± s，n=10)

2.3 肝組織HA、Hyp、LN、PCⅢ、Ⅳ-C含量變化 與模型組比較，紅芪多糖各組、黃芪多糖組、紅芪水煎液組肝組織HA、Hyp、LN、PCⅢ含量均明顯降低(P＜0.01，P＜0.05)。紅芪多糖高、中劑量組、黃芪多糖組Ⅳ-C含量明顯降低(P＜0.05)。紅芪多糖中劑量組與黃芪多糖組、紅芪多糖低劑量組與紅芪水煎液組比較，均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)表2、表3。

表2 各組大鼠肝組織HA、LN、Hyp含量比較(x ± s，n=10)

表3 各組大鼠肝組織PCⅢ、Ⅳ-C含量及膠原纖維面積比較(x ± s，n=10)

2.4 肝組織病理學(xué)改變

2.4.1 HE染色 ①正常組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝小葉中央靜脈擴(kuò)張充血，肝細(xì)胞形態(tài)正常，呈放射狀排列，匯管區(qū)小葉間靜脈擴(kuò)張充血，小葉間動(dòng)脈、膽管形態(tài)正常。②模型組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂不清，肝小葉中央靜脈擴(kuò)張充血，多數(shù)肝細(xì)胞體積增大，胞質(zhì)及部分肝血竇疏松化。少數(shù)肝細(xì)胞體大分裂，偶見(jiàn)病理性核分裂像，匯管區(qū)有少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，多量纖維結(jié)締組織增生并向肝小葉內(nèi)伸入，并有小膽管增生，此外可見(jiàn)中央靜脈周?chē)灿胁煌潭鹊哪z原纖維增生并沿肝竇散在分布，相互連接。③紅芪多糖各組和黃芪多糖組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，中央靜脈及肝內(nèi)小靜脈擴(kuò)張充血，肝索排列整齊，肝細(xì)胞水腫及壞死明顯改善。偶見(jiàn)點(diǎn)狀壞死灶，匯管區(qū)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，極少量纖維組織增生與模型組比較明顯改善，尤以紅芪多糖高劑量組改善顯著。見(jiàn)圖1。

2.4.2 Masson膠原染色 ①正常組僅于匯管區(qū)靜脈血管壁及膽管壁見(jiàn)少許膠原纖維沉積。②于匯管區(qū)及肝細(xì)胞索均見(jiàn)多量膠原纖維沉積。③紅芪多糖各組和黃芪多糖組肝組織纖維膠原均有不同程度改善，膠原纖維受到明顯抑制，肝小葉中央靜脈及匯管區(qū)纖維明顯減少，尤以紅芪多糖高劑量組改善效果明顯。見(jiàn)圖2。

圖1 各組大鼠肝組織切片HE染色(HE，×100)

圖2 各組大鼠肝組織切片Masson染色(Masson，×100)

2.4.3 肝組織膠原纖維面積變化 與模型組比較，紅芪多糖各組、黃芪多糖組、紅芪水煎液組肝組織膠原纖維面積均明顯減少(P＜0.01，P＜0.05)。紅芪多糖低劑量組與紅芪水煎液組比較有顯著性差異(P＜0.05)。紅芪多糖中劑量組與黃芪多糖組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)表3。

3 討論

肝纖維化是肝臟對(duì)慢性損傷的修復(fù)反應(yīng)，是慢性肝病的共同病理學(xué)改變。肝纖維化持續(xù)發(fā)展可導(dǎo)致肝硬化，甚至肝癌〔6，7〕，因此研究肝纖維化的進(jìn)程減緩和逆轉(zhuǎn)是近些年來(lái)中醫(yī)肝病研究的熱點(diǎn)之一〔8〕。隨著對(duì)肝纖維化發(fā)生機(jī)制認(rèn)識(shí)的不斷深化，現(xiàn)已證實(shí)肝纖維化是可逆性病變〔9〕。近年來(lái)中藥抗肝纖維化的研究取得了較大的進(jìn)展，汪少林等〔10〕認(rèn)為肝纖維化的病機(jī)演變是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程。仝欣等〔11〕用黃芪湯活性組分干預(yù)DMN誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠，發(fā)現(xiàn)黃芪總苷和甘草酸是抗肝纖維化的有效成分，可抑制肝纖維化進(jìn)展。周朝暉等〔12〕以甘草酸干預(yù)四氯化碳肝纖維化大鼠模型，2 w后大鼠肝臟炎癥及肝纖維化程度減輕，可能是甘草酸抑制了smad2表達(dá)及上調(diào)smad7，使TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)受到抑制，阻止了HSC活化。

現(xiàn)代藥理研究紅芪具有促進(jìn)機(jī)體免疫功能作用，提高特異性和非特異性免疫力，并對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝損傷有一定保護(hù)作用〔13〕。本研究結(jié)果表明紅芪多糖能降低肝纖維化血清ALT、AST水平，有降酶保肝作用。通過(guò)酶聯(lián)免疫法檢測(cè)證實(shí)，紅芪多糖對(duì)肝纖維化HA、PCⅢ、Ⅳ-C、LN、Hyp水平的升高有明顯抑制作用，并發(fā)現(xiàn)相同劑量的紅芪多糖、黃芪多糖藥效作用相似。病理組織學(xué)觀(guān)察結(jié)果，紅芪多糖能明顯抑制膠原的增生，減輕肝纖維化的程度。紅芪多糖具有良好的抗肝纖維化作用，為臨床應(yīng)用紅芪治療肝纖維化提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 孔維涵.單味中藥抗肝纖維化作用研究進(jìn)展〔J〕.天津藥學(xué)，2011;23(2):65-8.

2 李 季，葉 軍，薛冬英，等.中藥復(fù)方抗肝纖維化作用機(jī)制研究概況〔J〕.中醫(yī)雜志，2011;52(3):253-6.

3 金智生，孫丹鳳，汝亞琴，等.紅芪多糖對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病胰島素抵抗大鼠TNF-α的影響〔J〕.上海中醫(yī)藥雜志，2010;44(9):61-4.

4 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典〔M〕.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1986:2073.

5 李志鋼，楊晉翔，張 偉，等.肝纖維化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立與評(píng)價(jià)〔J〕.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009;16(4):43-6.

6 張 永，韓 寧，尹常健.柔肝抑纖抗DMN肝纖維化大鼠肝竇毛細(xì)血管的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2009;27(1):97-8.

7 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南〔J〕.中華肝病雜志，2011;19(1):13-24.

8 徐 翀.抗肝纖維化藥物研究進(jìn)展〔J〕.齊魯藥事，2011;30(7):404-9.

9 賈克明.加強(qiáng)對(duì)乙型病毒性肝炎治療的研究〔J〕.中華內(nèi)科雜志，2000;39(12):797-8.

10 汪少林，蘆秀琴.中醫(yī)藥抗纖維化研究概況〔J〕.甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005;22(2):52-3.

11 仝 欣，陳高峰，陸 雁，等.基于均勻設(shè)計(jì)分析黃芪湯活性組分抗二甲基亞硝胺大鼠肝纖維化的配伍作用〔J〕.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011;31(10):1389-93.

12 周朝暉，蔡 瑜，沈錫中.甘草酸對(duì)四氯化碳肝纖維化大鼠肝組織smad 2免疫組織化學(xué)表達(dá)的影響〔J〕.肝臟，2006;11(1):35-6.

13 任 遠(yuǎn)，馬 駿，崔笑梅，等.紅芪多糖對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝損傷的保護(hù)作用〔J〕.甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2000;17(S1):59-60.