林靈超，吳方圓

(浙江福立分析儀器有限公司，浙江溫嶺 317500)

香蘭素與乙基香蘭素是人工合成的香精，可增強(qiáng)食品口感，使其清香宜人[1]，是食品添加劑行業(yè)中不可缺少的重要原料，可直接應(yīng)用于化妝品、香皂、香煙、糕點(diǎn)、糖果、餅干、奶粉以及烘烤食品中[2]。但大劑量使用香蘭素可以導(dǎo)致頭痛、惡心、嘔吐、呼吸困難，甚至損傷肝、腎，對人體有較大危害。

常見香蘭素與乙基香蘭素的分析方法有氣相色譜法[3–4]、分光光度法[5–6]、高效液相色譜(HPLC)法[7]、液相色譜 – 質(zhì)譜聯(lián)用[8]及其它方法[9–11]。筆者采用HPLC法同時測定香蘭素與乙基香蘭素，通過對牛奶樣品的簡單處理和流動相的優(yōu)化，使得方法操作簡單，精密度高，重復(fù)性好，可用于牛奶中香蘭素與乙基香蘭素的日常檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：FL2200–II型，浙江福立分析儀器有限公司；

色譜柱：Ultimate XB–C18型(4.6 mm×250 mm，5μm)，月旭材料科技(上海)有限公司；

超聲波清洗器：HS 2060型，浙江福立分析儀器有限公司；

電子分析天平：JA 2004型，上海雷韻公司；

甲醇：色譜純，美國J. T. Baker 公司；

磷酸：優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

鹽酸、氫氧化鈉：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

香蘭素、乙基香蘭素標(biāo)準(zhǔn)樣品：含量均不小于99.9%，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；

牛奶樣品：批號為20121001，市售；

實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

分別取香蘭素與乙基香蘭素標(biāo)準(zhǔn)樣品各1 mL，以甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，配制成100 mg／L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。精密移取0.5 mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，以流動相溶解并定容于100 mL容量瓶中，配制成0.5 mg／L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，過濾，備用。

1.3 樣品溶液的配制

稱取牛奶樣品5 g，以25 mL 50℃熱水溶解，超聲 10 min，用 5 mol／L 鹽酸溶液調(diào)節(jié)至 pH 1.7，放置5 min，再用2 mol／L NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH 4.5，此時溶液變?yōu)閼覞嵋?，將此懸濁液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用純水定容至標(biāo)線后倒入漏斗，用快速定性濾紙過濾，棄去初濾液，收集中間濾液，充分搖勻，過濾，備用。

1.4 色譜條件

流動相：甲醇–0.01 mol／L磷酸溶液(體積比為 30∶70)；流速：1.0 mL／min；檢測波長：276 nm ；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相組成

考察了乙腈–乙酸、乙腈–磷酸二氫鉀、甲醇–磷酸等流動相，雖然乙腈的洗脫能力強(qiáng)于甲醇，但其毒性較大，而且香蘭素與乙腈香蘭素的色譜峰形、分離度均不符合分析要求；而用甲醇–磷酸體系可以得到標(biāo)準(zhǔn)對稱的色譜峰形，因此選擇甲醇–磷酸體系作為流動相。

2.2 前處理方法

牛奶中的蛋白質(zhì)含量較高，因此樣品要先用50℃熱水超聲提取，再經(jīng)酸沉淀蛋白后進(jìn)行測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：本方法加標(biāo)回收率大于98%，且操作簡單，可以滿足牛奶中香蘭素與乙基香蘭素的檢測要求。

2.3 色譜圖

在1.4色譜條件下香蘭素與乙基香蘭素標(biāo)準(zhǔn)溶液及牛奶樣品的高效液相色譜圖見圖1，由圖1可知，香蘭素與乙基香蘭素分離良好、峰形對稱，符合分析要求。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取香蘭素、乙基香蘭素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，按照1.4色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，分別測定香蘭素和乙基香蘭素的色譜峰面積，測定結(jié)果列于表1。由表1可知，香蘭素與乙基香蘭素色譜峰面積測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.09%，0.89%，表明儀器的精密度良好。

表1 香蘭素與乙基香蘭素標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜峰面積測定結(jié)果

2.5 線性關(guān)系、檢出限

分別精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.05，0.1，0.2，0.5，1.0 mL于10 mL容量瓶中，以流動相稀釋至標(biāo)線，搖勻，制得不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別精密吸取20 μL，按1.4色譜條件進(jìn)樣測定色譜峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度X(μg／mL)為橫坐標(biāo)，峰面積值Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，在0.5～10μg／mL的進(jìn)樣范圍內(nèi)，香蘭素的線性方程為Y=6.656×10–6X+0.193，r2=0.9997；乙基香蘭素的線性方程為Y=8.022×10–6X+0.194，r2=0.9997，表明二者濃度與色譜峰面積線性關(guān)系良好。

將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液以不同倍數(shù)稀釋后進(jìn)行測定，以峰高為基線噪音3倍時的質(zhì)量濃度為檢出限，測得香蘭素和乙基香蘭素的檢出限分別為5.68 μg／L和12.8 μg／L。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一牛奶樣品6份，照上述樣品制備方法制備，按1.4色譜條件進(jìn)樣測定香蘭素與乙基香蘭素的含量，測定結(jié)果見表2。由表2可知，牛奶樣品中香蘭素與乙基香蘭素平均含量為2.014 mg／kg和1.990 mg／kg，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.35%，1.57%。表明方法測量重復(fù)性良好。

表2 牛奶樣品中香蘭素與乙基香蘭素含量測定結(jié)果

2.7 加標(biāo)回收試驗(yàn)

取牛奶樣品9份，每份為5 g，每3份為一組，每組分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液4，5，6 mL，按照1.3樣品溶液的配制方法進(jìn)行提取和定容后，按1.4色譜條件測定，測定結(jié)果見表3。由表3可知，實(shí)驗(yàn)所得香蘭素、乙基香蘭素平均加標(biāo)回收率為99.8%，98.4%；測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.06%，2.31%。

表3 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)語

牛奶樣品經(jīng)50℃熱水超聲提取并酸沉淀處理后，用HPLC法同時測定其中的香蘭素與乙基香蘭素，方法簡便，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，可以作為日常的檢測。

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