朱 勇 施舜繽 沈振亞

1.南通大學附屬吳江醫(yī)院胸外科，江蘇吳江 215200；2.蘇州大學附屬第一醫(yī)院心血管外科，江蘇蘇州 215000

目前，由于同種器官匱乏，器官移植的數(shù)量受到限制，異種移植是器官移植目前的重要研究方向之一。遲發(fā)性異種排斥反應（DXR）成為了異種器官移植的主要障礙[1-2]。研究表明T細胞在遲發(fā)性異種排斥反應（DXR）中起重要作用，特別是CD4+T細胞介導異種細胞排斥反應尤為重要[3-4]。誘導免疫耐受是抑制細胞免疫反應的最理想方法。而混合性嵌合是目前比較有前景的誘導異種免疫耐受的策略之一[5]。在同種移植和協(xié)調(diào)性異種移植領域，利用混合嵌合體可誘導出供者特異性的免疫耐受[6]。但在非協(xié)調(diào)性異種移植供受體間，利用相同的方法卻不能獲得免疫耐受，其中原因之一就是供者骨髓細胞在受體體內(nèi)迅速消失而不能形成持續(xù)穩(wěn)定的嵌合體。有研究發(fā)現(xiàn)在比較豬-SCID/NOD小鼠（巨噬細胞功能缺陷）及豬-SCID小鼠嵌合體模型發(fā)現(xiàn)，前者的嵌合狀態(tài)維持明顯長于后者[7]。本研究在豚鼠到大鼠實驗動物模型中，利用脂質(zhì)體包裹clodronate清除受體巨噬細胞后，采用非清髓性的預處理方案誘導建立混合嵌合體，研究巨噬細胞在建立非協(xié)調(diào)性異種混合嵌合體中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

供體選用健康三色豚鼠，雌雄不限，受體選用健康SD雌性大鼠，體重250～300g，實驗動物均由蘇州大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SYXK（蘇）2002-0037。取7d前開始飲紅霉素（250mg/L）和慶大霉素（320mg/L）水清潔級雌性SD大鼠，（D-0）接受60Coγ射線（劑量率0.5Gy/min，總劑量5.0Gy）全身照射，照射后4h內(nèi)經(jīng)后肢隱靜脈輸注2×108/mL豚鼠BMC的細胞懸液0.8mL（24h實驗組大鼠輸注經(jīng)CFSE標記的豚鼠BMC細胞懸液），2d（D-2）后經(jīng)環(huán)磷酰胺預處理（腹腔內(nèi)注射CTX，50mg/kg），實驗動物隨機分為3組，每組10例（各組5例預處理后24h處死）：A組（豚鼠BMC移植組）：僅行豚鼠BMC移植；B組（豚鼠BMC移植組+空脂質(zhì)體移植組）：BMC移植前3d經(jīng)后肢隱靜脈輸注不含clodronate空脂質(zhì)體（每天2次，每次1mL），余同A組；C組（豚鼠BMC移植組+包裹clodronate脂質(zhì)體移植組）：BMC移植前3d經(jīng)后肢隱靜脈輸注含clodronate脂質(zhì)體共120mg/kg（每天2次），余同A組。

1.2 豚鼠骨髓細胞制備

將豚鼠頸椎脫臼處死后，置于75%酒精中浸泡15min，無菌條件下取股、脛骨，用RPMI 1640沖洗骨髓腔，反復吹打，分散細胞，200目鋼篩過濾制成單細胞懸液，加紅細胞裂解液裂解紅細胞后PBS液洗2次，以RPMI 1640調(diào)整細胞濃度為2×108個/mL備用，臺盼蘭染色法判定細胞活率＞90%。

1.3 脂質(zhì)體包裹Clodronate制備

脂質(zhì)體的制備采用反相蒸發(fā)技術，即70.9mg磷酸卵磷脂、10.8mg膽固醇溶于10mL氯仿溶液中，同時加入1.8mg/mL p-aminophenyla-D-mannopyranoside甲醇溶液2mL，形成脂質(zhì)，加入10mL clodronate（10mg/mL）PBS溶液，于56℃超聲水浴10min，從而形成水包油乳劑，進而于56℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，形成完整脂質(zhì)體。空白脂質(zhì)體即在形成脂質(zhì)體后加入10mL PBS溶液，余同脂質(zhì)體制作。制備好脂質(zhì)體及空白脂質(zhì)體置4℃冰箱備用。

1.4 CFSE標記豚鼠骨髓細胞及體內(nèi)追蹤檢查

活體染料羧基熒光素乙酰乙酸（carboxy fluoresceindiacetate，succinimidyl ester，CFSE） 用 DMSO 溶解成 10mmol/L 的儲存液，-20℃保存。臨用前，取適量用PBS 稀釋成5μmol/L 的工作液，平衡至室溫備用。取制備好的豚鼠骨髓細胞， 加入等體積的 CFSE 工作液（終濃度為 2.5μmol/ L） ， 充分混勻后在室溫條件下輕輕振蕩10min。然后用PBS 離心（300g，5min）洗滌細胞2 次，懸浮于含100mL/L FBS 的RPMI1640完全培養(yǎng)液中，并調(diào)整細胞密度為2×108/L。注入CFSE標記的豚鼠骨髓細胞后1、6、12、24h分別取大鼠外周血50～100μL，裂解紅細胞后流式細胞儀檢測CFSE標記細胞百分比。同是于24h處死受體大鼠取脾、骨髓細胞，制得單個核細胞后行流式細胞檢查CFSE標記細胞百分比。

1.5 大鼠肝、脾CD68免疫組化檢查

CD68是巨噬細胞特異性標志物，本實驗用免疫組化方法檢查。免疫組化染色采用SP法（Streptavidin-biotin immunoperoxidase method），操作步驟按說明書染色步驟進行。

1.6 嵌合體嵌合率的測定

A、B、C組動物接受60Coγ射線全身照射后行豚鼠BMC移植，經(jīng)環(huán)磷酰胺預處理，在21d、35d取外周血檢測嵌合率。取A、B、C組大鼠的外周血離心分離得到單個核細胞，用PBS調(diào)整細胞濃度至1×106/100μL；取上述細胞懸液100μL，加入小鼠抗豚鼠MHC Class Ⅱ抗體，混勻，避光、室溫、孵育15min；加入3mL PBS緩沖液，混勻，1500rpm離心5min，棄除上清，管底留少許液體（≤100μL）；加入1Test PE標記的大鼠抗小鼠IgA二抗，混勻，避光、室溫、孵育15min；加入3mL PBS緩沖液，混勻，1500rpm離心5min，棄上清，加入0.5～1mL PBS重懸，6h內(nèi)上流式細胞儀檢測，通過細胞陽性率來檢測受體大鼠的外周血中豚鼠細胞比例。

1.7 外周血中CD3+T細胞、CD4+T細胞和CD8+T細胞檢測

正常大鼠及實驗組BMC移植后21d流式細胞儀檢測外周血中CD3+T細胞、CD4+T細胞和CD8+T細胞的水平。取受體大鼠外周血100μL，加入帶標記的CD3、CD4、CD8抗體，混勻，避光、室溫、孵育15～20min后加入A液、B液和C液進行紅細胞裂解；加入5倍以上體積PBS緩沖液，混勻，1500rpm離心5min，棄除上清，管底留少許液體（≤100μL）；加入0.5～1mL PBS重懸，流式細胞儀檢測。

1.8 單向混合淋巴細胞反應（mixed lymphocyte reaction）

分別將供體（豚鼠）和受體（大鼠）脾臟制成細胞濃度為1.0×107/mL的淋巴細胞懸液。以各實驗組SD大鼠的淋巴細胞作為MLR的反應細胞，豚鼠淋巴細胞的作為MLR刺激細胞，刺激細胞經(jīng)絲裂霉素處理；取96孔細胞培養(yǎng)板，設置零孔（加入RPMI 1640培養(yǎng)基150μL，不含細胞）、對照孔O組（加入正常大鼠脾細胞懸液100μL、培養(yǎng)基50μL）和待檢孔A、B、C組（每孔加入培養(yǎng)基50μL、供受體淋巴細胞懸液各50μL），每份標本設三復孔。將培養(yǎng)板置于濕度100%、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)96h后，加入CCK-8 10μL /孔；培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4h后在酶標儀上測定OD值（選擇檢測波長450nm）。MLR的刺激效應按照下列公式計算：刺激效應=（實驗組OD值－對照組OD值）/ 對照組OD值×100%。

1.9 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計均使用SPSS17.0軟件包進行統(tǒng)計。統(tǒng)計方法使用student’s t檢驗和方差分析，數(shù)據(jù)以（± s）表示，檢驗水準：α=0.05。

2 結果

2.1 巨噬細胞特異性標志物CD68免疫組化檢查

預處理后第1天，C組肝臟、脾臟紅髓及紅白髓移行處巨噬細胞消失，白髓處有仍有少量CD68陽性巨噬細胞，到預處理后第21天時，肝脾中巨噬細胞已恢復與正常對照大鼠相似。而A、B兩組與正常對照大鼠相比無變化（圖1、2）。說明脂質(zhì)體包裹clodronate能清除大鼠體內(nèi)巨噬細胞。

2.2 豚鼠骨髓細胞輸注24h內(nèi)受體外周血中豚鼠細胞比例測定

A、B、C組動物接受60Coγ射線全身照射后行經(jīng)CFSE標記豚鼠BMC移植，移植后1、6、12、24h分別檢測大鼠外周血中CFSE標記細胞比例，即豚鼠BMC細胞比例。在各時間點中，C組大鼠外周血中CFSE標記細胞比例均明顯高于A組及B組，而A組及B組之間無顯著差異（表1），說明受體去除巨噬細胞后可提高其外周血中豚鼠BMC比例，即大鼠巨噬細胞在豚鼠BMC在其外周血中迅速消失起作用。

圖1 正常大鼠肝臟高表達CD68（光鏡×400）

圖2 正常大鼠脾臟高表達CD68（光鏡×400）

圖3 C組大鼠預處理后24h肝臟無CD68表達（光鏡×400）

圖4 C組大鼠預處理后24h脾臟CD68低表達（白髓少量表達）（光鏡×400 ）

表1 移植24h內(nèi)各時間點大鼠外周血中豚鼠細胞變化（± s ，%）

表1 移植24h內(nèi)各時間點大鼠外周血中豚鼠細胞變化（± s ，%）

注：移植后1h：與A組相比，*P=0.006；與B組相比，▲P=0.011；與A組相比，■P=0.781；移植后6h：與A組相比，*P＜0.001；與B組相比，▲P＜0.001；與A組相比，■P=0.721；移植后12h：與A組相比，*P＜0.001；與B組相比，▲P＜0.001；與A組相比，■P=0.897；移植后24h：與A組相比，*P＜0.001；與B組相比，▲P＜0.001；與A組相比，■P=0.714

組別 移植后1h 移植后6h 移植后12h 移植后24h A組 3.26±0.62 1.54±0.32 0.94±0.17 0.70±0.12 B組 3.36±0.44■ 1.46±0.25■ 0.96±0.15■ 0.74±0.11■C組 4.42±0.59*▲ 3.36±0.44*▲ 2.58±0.35*▲ 2.12±0.24*▲

2.3 豚鼠骨髓細胞輸注21d及35d嵌合率檢測

3組在21d后取外周血均檢測到一定比例的嵌合體細胞，到預處理后35d觀測發(fā)現(xiàn)嵌合率均明顯降低。流式細胞儀檢測C組嵌合率明顯高于A、B兩組（P＜0.05），A組與B組之間嵌合率無顯著差異（表2），說明去除巨噬細胞明顯提高嵌合率。

表2 受體大鼠的外周血中豚鼠源性細胞檢測結果（嵌合率）（± s ，%）

表2 受體大鼠的外周血中豚鼠源性細胞檢測結果（嵌合率）（± s ，%）

注：21d與A組相比，*P＜0.001；與B組相比，▲P＜0.001；與A組相比，■P=0.842；35d與A組相比，*P=0.002；與B組相比，▲P=0.001；與A組相比，■P=0.864

組別 預處理后21d 預處理后35d A組 3.12±0.29 0.58±0.18 B組 3.06±0.27■ 0.56±0.15■C組 5.12±0.70*▲ 1.04±0.21*▲

2.4 外周血中CD3+T細胞、CD4+T細胞何CD8+T細胞測定

從表3中可以看出經(jīng)輻照后T細胞亞群中CD3+T細胞比例下降，約為正常大鼠的20%；CD3+CD4+T細胞和CD3+CD8+T細胞亦下降，而CD3+CD4+T細胞下降幅度更大，但兩者比值對照組和各實驗組之間無差異，與正常SD大鼠有顯著差異。

表3 各組淋巴細胞亞群（± s ，%）

表3 各組淋巴細胞亞群（± s ，%）

注：（1）CD3+T細胞：與同期正常大鼠照射組相比，*P＜0.01；對照組、A組、B組及C組組間兩兩相比，▲P＞0.05；（2）對照組即在大鼠全身照射后輸注生理鹽水，余同A組

組別 CD3+T細胞 CD3+CD4+T細胞 CD3+CD8+T細胞 CD4+/CD8+正常SD大鼠 52.28±5.61 42.46±7.42 10.88±1.72 4.08±1.40對照組 14.20±0.83*▲ 9.47±0.63*▲ 4.73±0.29*▲ 2.01±0.12*▲A組 16.34±0.75*▲ 11.08±0.51*▲ 5.26±0.33*▲ 2.11±0.11*▲B組 16.42±0.48*▲ 10.93±0.26*▲ 5.49±0.31*▲ 1.99±0.10*▲C組 17.18±0.79*▲ 11.52±0.97*▲ 5.66±0.51*▲ 2.05±0.30*▲

表4 各組刺激效應值（100%）

2.5 單向混合淋巴細胞反應

經(jīng)豚鼠骨髓細胞移植3組（A、B、C組）較未行骨髓細胞移植的兩組（D、E組）的受體淋巴細胞增殖顯著減弱。其中，C組刺激效應小于A、B兩組，A、B兩組之間刺激效應無顯著差異，D、E兩組之間刺激效應也無顯著差異。

3 討論

Clodronate 是一種人工合成的雙磷酸酯，脂質(zhì)體包裹clodronate可被巨噬細胞吞噬、消化，進而clodronate釋放、聚集于細胞內(nèi)，當細胞內(nèi)clodronate達到一定濃度后，可導致巨噬細胞凋亡[8-9]。本研究中，輸注脂質(zhì)體包裹clodronate早期，SD大鼠肝臟、脾臟紅髓及紅白髓移行處巨噬細胞消失，說明脂質(zhì)體包裹clodronate能清除大鼠體內(nèi)巨噬細胞。而白髓內(nèi)有仍有少量CD68陽性巨噬細胞，這與Van Rooijen等實驗結果相似，同時他們發(fā)現(xiàn)輸注脂質(zhì)體包裹clodronate也不能清除胸腺、骨髓及淋巴結內(nèi)的巨噬細胞，并且在胸腺內(nèi)樹突狀細胞數(shù)無變化?？紤]原因可能是脂質(zhì)體大小與通入脾白髓、胸腺等組織的微循環(huán)血管內(nèi)皮組織間隙相似，從而使脂質(zhì)體不能進入這些組織內(nèi)[8，10]。停止輸注脂質(zhì)體包裹clodronate后，大鼠體內(nèi)的巨噬細胞會逐漸恢復。由此可見，利用脂質(zhì)體包裹clodronate的方法清除巨噬細胞的動物模型是可行的。而其對胸腺內(nèi)巨噬細胞及樹突狀細胞不予清除，對本實驗用此模型研究以中樞性克隆清除為主要作用機制的異種嵌合體尤為重要。

在非協(xié)調(diào)性異種移植供受體間，利用相同的方法卻不能獲得免疫耐受，其中原因之一就是供者骨髓細胞在受體體內(nèi)迅速消失而不能形成持續(xù)穩(wěn)定的嵌合體。有學者認為在非協(xié)調(diào)性異種移植中，由于供者來源的骨髓細胞缺乏供者MHC-I類分子，不能被供者NK細胞抑制性受體（KIR）識別，因而激活供者NK細胞而被殺傷清除，因此NK細胞在供體骨髓細胞迅速消失中起主要作用。然而Sykes M等[11]利用豬—SCID小鼠的模型研究表明，NK細胞對豬造血細胞在SCID小鼠體內(nèi)迅速消失并不起主要作用。

我們的實驗中，利用非清髓的方法建立豚鼠到大鼠的非協(xié)調(diào)性異種混合嵌合體模型。我們發(fā)現(xiàn)在豚鼠骨髓細胞移植后，豚鼠骨髓細胞在受體大鼠外周血內(nèi)迅速減少。而在移植前利用脂質(zhì)體包裹clodronate的方法清除受體大鼠巨噬細胞組，無論是移植后24h內(nèi)受體外周血、骨髓及脾臟中豚鼠源性細胞比例，還是預處理后21d及35d測外周血嵌合率，都明顯高于對照兩組。這些都說明大鼠的巨噬細胞在豚鼠BMC移植后迅速減少中起重要作用，在BMC移植前去除巨噬細胞可提高嵌合率。

由于豚鼠BMC細胞移植前去除巨噬細胞，豚鼠細胞早期在外周血中被巨噬細胞清除減少，因此24h內(nèi)測的豚鼠細胞比例均較其他兩組增高。隨著外周血中豚鼠細胞增多，植入大鼠骨髓中的豚鼠BMC細胞相應增多，使豚鼠源性各造血系細胞生成增多，它們在胸腺內(nèi)植入后產(chǎn)生介導克隆丟失的樹突狀細胞和胸腺細胞，最終使來之豚鼠并遷移到外周的成熟胸腺細胞增多。因此，在我們的實驗中，預處理后21d和35d發(fā)現(xiàn)去除巨噬細胞組測嵌合率明顯高于細胞移植前未去除巨噬細胞組。而此時從免疫組化結果來看，清除巨噬細胞組的大鼠體內(nèi)巨噬細胞已恢復到正常水平。因此在豚鼠BMC移植后早期（大鼠巨噬細胞恢復正常水平前）種植入大鼠骨髓中增多對提高嵌合水平有重要的作用。造血干細胞移植建立嵌合體常需要超大劑量干細胞，限制了其在臨床的運用，而我們的實驗似乎可以提供一些新的思路。

T細胞亞群的檢測對于判斷機體免疫耐受情況有重要意義[12]，在本實驗中，我們選用了CD3+、CD4+、CD8+T細胞亞群的檢測。CD4+T細胞參與T細胞依賴性異種抗體的合成，可介導補體依賴的細胞毒和ADCC作用，CD8+T細胞作為非依賴性的細胞毒性T細胞，在DXR中可直接殺傷移植物。如CD4+和CD8+T細胞均升高、且CD4/ CD8比值上升，這預示著排斥反應即將發(fā)生。在我們的實驗中，預處理21d后對照組及各BMC輸注組CD3+、CD4+、CD8+T細胞較正常大鼠均降低，而在CD4+、CD8+T細胞中，CD4+T細胞降幅更大，故CD4/CD8比值下降。但在BMC組與對照組的相比中，CD4/ CD8比值下降的幅度無顯著差異。因此我們認為，混合嵌合體對T細胞亞群的生成與分布并無影響，CD4/ CD8比值下降可能與CD4+T細胞比CD8+T細胞對γ射線照射更為敏感有關。

MLR是評價T細胞免疫應答功能的經(jīng)典體外實驗方法，可間接反映體內(nèi)T細胞對某一組織相容性抗原的免疫應答功能，對客觀地判斷T細胞免疫應答功能、免疫耐受的誘導及移植物的排斥均有重要的參考價值[13-14]。本實驗通過對單向混合淋巴細胞培養(yǎng)結果的觀察，發(fā)現(xiàn)BMC移植三組刺激效應都低于對照兩組，提示異種間建立混合嵌合體雖然對T細胞亞群的分布無影響，但其識別異種抗原的能力有所下降。而BMC移植前去除巨噬細胞組21d嵌合率較其他兩組高，刺激效應較其他兩組BMC移植組低，且有顯著差異，說明提高嵌合水平可獲得更高程度的免疫抑制。

綜上所述，通過在BMC移植前清除受體巨噬細胞，增加了供體BMC在受體體內(nèi)的存活，從而提高嵌合水平，獲得了更高水平的免疫抑制，這為研究混合嵌合體在非協(xié)調(diào)性異種器官移植中免疫耐受機制提供必要的理論依據(jù)。

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