丁珊珊，楊振泉，李寶利，潘志明，焦新安

2.揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，揚(yáng)州 225009

副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus，以下簡(jiǎn)稱Vp）屬于弧菌科弧菌屬，是一種革蘭氏陰性嗜鹽細(xì)菌，主要分布在近海岸的海水、海河交界處和魚(yú)類、蝦類、貝類等海產(chǎn)品中。江蘇地區(qū)2008年和2009年食源性致病菌監(jiān)測(cè)研究數(shù)據(jù)顯示Vp檢出率分別為15.9%和7.8%，居于首位，生食水產(chǎn)品導(dǎo)致食源性疾病的風(fēng)險(xiǎn)較高［1］。因此，控制在海產(chǎn)品中Vp的帶菌量，建立科學(xué)的減菌和殺菌方法至關(guān)重要。

目前對(duì)于Vp的控制手段主要有流水凈化、溫度處理、高壓處理、輻射等，但是這些方法都不能經(jīng)濟(jì)安全有效地抑制水產(chǎn)品中Vp［2］。有研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)酸食品添加劑能有效抑制Vp，但是在抑制過(guò)程中食品的風(fēng)味發(fā)生了改變［3］。2000年，Andrews等人提出低溫巴氏殺菌（48℃～50℃，5 min）可使貝類中Vp（1.2×105MPN/g）降低到不能檢測(cè)水平（＜3MPN/g），但是這種處理可能會(huì)導(dǎo)致貝內(nèi)容物發(fā)生變化［4］。很少有研究報(bào)道有機(jī)酸和溫度聯(lián)合處理對(duì)于Vp的作用，為此，我們建立一種既能降低Vp帶菌量，又能最大限度地保證海產(chǎn)品鮮度的新型控制手段。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑Vp大流行株RIMD2210663由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院饋贈(zèng)；Vp標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC33847和ATCC17802由上海疾病預(yù)防與控制中心饋贈(zèng)；環(huán)境分離株Vp098、Vp343和Vp012由揚(yáng)州大學(xué)江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。

瓊脂培養(yǎng)基TCBS購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。LBS液體培養(yǎng)基、高離子強(qiáng)度鹽溶液（0.1 mol/L KCl＋0.01mol/L NaCO3＋ 0.04 mol/L Na HCO3）、50 mmol/L CaCl2、4 M KCl均由本實(shí)驗(yàn)室自制，其它試劑均為分析純。1.2 方法

1.2.1 菌懸液制備 挑取 RIMD2210663、ATCC33847、ATCC17802、Vp098、Vp343、Vp012的TCBS典型單菌落至LBS培養(yǎng)液，37℃，180 r/min，過(guò)夜振蕩培養(yǎng)。分別吸取10 μL過(guò)夜培養(yǎng)物至新鮮LBS培養(yǎng)液，37℃，180 r/min，振蕩培養(yǎng)4～5 h，測(cè)六種菌株的OD600值，并調(diào)OD600至0.8左右。均勻混合 RIMD2210663、ATCC33847、ATCC17802、Vp098、Vp343、Vp012這6種菌株，制成混合菌懸液備用。1.2.2Vp死亡率測(cè)定 用無(wú)菌微量移液器分別吸取處理前后菌液100μL，沿管壁緩緩注入含有900μL PBS的無(wú)菌1.5 m L離心管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖使其混合均勻，制成1∶100的樣品勻液。根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。選取2～3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種3個(gè)無(wú)菌TCBS平皿，每皿100μL。選取菌落數(shù)在20 CFU－300 CFU之間的平板，分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑Vp菌落，典型菌落為墨綠色。

計(jì)算公式：

1.2.3單因素試驗(yàn) 以死亡率為指標(biāo)，分別對(duì)p H、溫度、時(shí)間作單因素試驗(yàn)。吸取100μL混合菌液于1.5 m L中，12 000 r/min離心8 min，重懸，在45℃、50℃、55℃、60℃、65℃水浴中處理，分別于5 s、25 s、45 s、65 s、85 s取樣分析細(xì)菌的死亡率。同樣分別吸取100μL混合菌液，離心沉淀，用PBS重懸，稀釋，涂板，37℃，培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)得到處理前菌落數(shù)，其余分別用p H2.5、p H3.5、p H4、p H4.5、p H5的檸檬酸溶液重懸，在55℃水浴中處理15 s，稀釋，涂布，37℃，培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)，計(jì)算死亡率。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化溫度、p H和時(shí)間 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box－Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以溫度、p H、時(shí)間3個(gè)因素為自變量，菌株死亡率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析法在三因素三水平上對(duì)處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最大死亡率。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)如表1所示。根據(jù)表1，Box－Benhnken軟件自動(dòng)生成17種組合條件，如表2所示。例如第一種組合是吸取兩組混合菌懸液各100μL，一組直接離心、PBS重懸、稀釋涂板，37℃培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)，獲得處理前菌落數(shù)，另一組混合于1 mL p H5.5檸檬酸溶液中，60℃水浴處理15 s，然后離心、PBS重懸，稀釋涂布，37℃培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)，獲得處理后菌落數(shù)，以計(jì)算死亡率。其它16種組合根據(jù)具體條件做法同上。

1.2.5 最優(yōu)條件的驗(yàn)證 根據(jù)17種組合的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，軟件自動(dòng)分析得出最佳組合條件，對(duì)該條件進(jìn)行驗(yàn)證并考查該條件對(duì)魚(yú)蛋白活性的影響。

1.2.5.1 樣品處理 將市售新鮮三文魚(yú)肉冷凍狀態(tài)下切割成大小均一的塊狀，用滅菌生理鹽水浸泡洗滌9～10次，并檢測(cè)Vp的攜帶情況。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Tab.1 Factors and their coding levels in response surface analysis

1.2.5.2 人工污染 取6塊魚(yú)肉樣品解凍后置于混合菌液中浸泡10～15 min，用鑷子取出分裝至玻璃瓶中（每瓶1片），其中3瓶做對(duì)照組，加PBS，攪勻，稀釋涂布于TCBS平板，37℃培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)。其余3瓶做處理組，加p H4.96檸檬酸溶液，在55.5℃條件下處理25 s后，攪勻，稀釋涂布于TCBS平板，37℃培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)。

1.2.6 魚(yú)蛋白活性的測(cè)定

1.2.6.1 肌原纖維蛋白的制備 為了進(jìn)一步觀察處理?xiàng)l件對(duì)魚(yú)蛋白活性的影響，參考李來(lái)好等［5］的報(bào)道取三文魚(yú)肉2 g各兩份，一份做對(duì)照組，一份用p H4.96，55.5℃，25 s處理，兩組分別放在研缽中并置于冰箱急凍室冷凍5～10 min，取出研碎，在凍水浴中邊研磨邊加入20 m L預(yù)冷的高離子強(qiáng)度鹽溶液，研磨15 min。然后加10倍冰水稀釋，攪勻放在4 000 r/min的離心機(jī)中離心10 min，棄去上清液，取出沉淀物。再同法洗滌離心3次，最后得到的肌原纖維沉淀物加Tris－HCl緩沖液（p H7.0）勻漿攪勻，然后定容至100 m L，所得的肌原纖維懸濁液供Ca2＋－ATPase活性測(cè)定。

1.2.6.2 Ca2＋－ATPase 活性的測(cè)定 在試管中加入 20 mmol/L Tris－HCl 2.5 mL、50 mmol/L CaCl21.0 mL、4 M KCl 1.0 m L、6.67 mmol/L d ATP 1.5 m L和4.0 m L肌原纖維蛋白酶液，最后加入1.0 m L15%的三氯醋酸終止反應(yīng)。用鉬酸銨法在314 nm波長(zhǎng)測(cè)定磷含量。

2 結(jié) 果

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果 在45℃、50℃、55℃、60℃、65℃溫度條件下分析了溫度對(duì)Vp死亡率的影響（圖1a），死亡率隨溫度的升高而增大，45℃至50℃死亡率上升最迅速，上升了近13%，55℃至60℃上升較迅速，上升了近5%，當(dāng)溫度大于60℃時(shí)，死亡率已接近100%，變化不顯著。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用情況，適宜的溫度范圍確定為50℃～60℃。

在p H2.5、p H3.5、p H4、p H4.5、p H5.5條件下分析了p H對(duì)Vp死亡率的影響（圖1b），Vp死亡率隨p H的增大而降低。Vp在p H2.5的檸檬酸溶液中死亡率近100%，當(dāng)p H至5.5時(shí)死亡率降低了近5%，這說(shuō)明Vp有一定的耐酸能力。考慮到食品風(fēng)味的需求，適宜的p H范圍確定為4.5～5.5。

圖1 單因素試驗(yàn)注：圖1（a）、圖1（b）、圖1（c）分別為溫度、p H、時(shí)間作為單因素對(duì)Vp 死亡率的影響。Fig.1 Single factor experimentNote：（a），（b），and（c）show the effects of single factor temperature，p H and time，respectively，on the death of Vp.

在不同作用時(shí)間分析了時(shí)間對(duì)Vp死亡率的影響對(duì)Vp死亡率的影響（圖1c），曲線呈S型，在起始25 s內(nèi)，死亡率僅增加了1%，在25 s至45 s，死亡率增加了近4%，65 s后死亡率接近100%。為了保證食品鮮度，盡可能選擇較短作用時(shí)間，故選擇5 s－25 s。

2.2 響應(yīng)面分析法對(duì)控制條件的優(yōu)化

2.2.1 模型建立及顯著性檢驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以溫度（A）、時(shí)間（B）、p H（C）為自變量，以死亡率（y）為響應(yīng)值，分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

二次多項(xiàng)回歸模型方程為：

對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3，模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)見(jiàn)表4。由表3可以看出P＜0.000 1，說(shuō)明模型方程不同處理間的差異顯著；失擬項(xiàng)P＝0.1262＞0.05，不顯著；模型的校正決定系數(shù)R2Adj＝96.73%，說(shuō)明該模型能解釋約96.73%響應(yīng)值的變化，僅有總變異3.27%不能用此模型解釋，相關(guān)系數(shù)R＝99.28%，說(shuō)明該模型擬合程度良好。表4回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知：模型一次項(xiàng)A（P＜0.05）、C（P＜0.05）顯著；二次項(xiàng) A2、C2顯著；交互項(xiàng)不顯著。

表2 響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 回歸模型方差分析Tab.3 Variance analysis of regression equation

2.2.2 響應(yīng)曲面分析及優(yōu)化 由上述結(jié)果得出，T和p H是對(duì)Vp死亡率影響最大的因素，其中以p H尤為重要?？梢钥闯觯S著溫度的升高和p H的降低，死亡率也逐漸升高。當(dāng)溫度和p H分別在53.5℃～60℃和4.75～5.25的范圍內(nèi)時(shí)，死亡率最大。響應(yīng)面軟件給出的最優(yōu)組合是：55.5℃、25 s、p H4.96，模型預(yù)測(cè)死亡率為97.36%。

2.3 最優(yōu)條件的驗(yàn)證

2.3.1Vp死亡率 人工污染三文魚(yú)，根據(jù)下面三組條件處理，比較死亡率。從上圖3可以看出，70℃，25 s處理后死亡率達(dá)到76.09%，p H4.6，5 s處理后死亡率達(dá)到94.1%，而55.5℃，25 s與p H4.96聯(lián)合處理后死亡率達(dá)到97.07%，這說(shuō)明p H和溫度的聯(lián)合作用優(yōu)于它們單獨(dú)處理效果。

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表Tab.4 Significance test for regression coefficients

圖2 Vp的死亡率與個(gè)兩因素的函數(shù)關(guān)系圖和等高線圖Fig.2 Response surface and contour plots for the effect of cross－interaction among two factors on death rate of Vibrio parahaemolyticus

圖3 在三文魚(yú)上驗(yàn)證Vp死亡率Fig.3 Death rate of Vp on salmon

2.3.2 魚(yú)蛋白活性 Ca2＋－ATPase活性單位，是在一定的條件下，以每分鐘每毫克肌原纖維蛋白酶分解ATP所釋放的磷酸根中磷微克分子量來(lái)計(jì)算（μmol Pi/min.mg pro.）。圖4顯示，與對(duì)照組相比，55.5 ℃、p H4.96、25 s處理后 Ca2＋－ATPase活性差異不顯著，而p H2，25 s和80℃，25 s處理后，Ca2＋－ATPase活性顯著降低。這說(shuō)明55.5 ℃、p H4.96、25 s的處理?xiàng)l件從某種程度上可以保證魚(yú)蛋白的活性。

圖4 魚(yú)蛋白活性的測(cè)定結(jié)果Fig.4 Ca2＋ －ATPase activity of salmon

3 討 論

作為某些天然成分的有機(jī)酸對(duì)人類無(wú)害，被列為食品添加劑。因?yàn)橛袡C(jī)酸的抗菌效應(yīng)，它還被應(yīng)用于控制飼料原料和飼料保存中細(xì)菌的生長(zhǎng)［6］。有機(jī)酸通過(guò)兩種途徑作用于微生物，一是p H的影響，二是其陰離子還具有獨(dú)特的殺菌功能［7］。對(duì)于引起胃腸疾病的病原菌，Russell等人認(rèn)為，有機(jī)酸的殺菌作用主要是由其陰離子引起的。無(wú)機(jī)酸作用不佳，可能在于不具有有機(jī)酸陰離子的類似作用［8］。有機(jī)酸的抗菌效果隨著有機(jī)酸碳鏈的增長(zhǎng)和不飽和度的增加而增強(qiáng)［9］。有人研究報(bào)道檸檬酸飲料對(duì)弧菌有強(qiáng)烈的抑制作用［10］。

目前，水產(chǎn)品鮮度的評(píng)價(jià)方法主要包括感官評(píng)價(jià)、微生物檢驗(yàn)、化學(xué)檢驗(yàn)、物理指標(biāo)評(píng)價(jià)和鮮度指示蛋白評(píng)價(jià)等［11］?；诒狙芯康哪康氖且疾鞙囟群退嵝原h(huán)境對(duì)魚(yú)鮮度的影響，我們借鑒李來(lái)好［5］等人的關(guān)于鯔魚(yú)蛋白質(zhì)變性研究，選擇魚(yú)蛋白Ca2＋－ATPase活性作為指標(biāo)。魚(yú)的肌動(dòng)蛋白和肌動(dòng)球蛋白切斷ATP末端的磷酸基團(tuán)產(chǎn)生ADP和Pi。通過(guò)比色測(cè)定，測(cè)定無(wú)機(jī)磷含量，可以表明ATPase活性。無(wú)機(jī)磷含量的測(cè)定采用釩鉬酸銨法。

我們研究發(fā)現(xiàn)，70℃處理25 s時(shí)，Vp死亡率達(dá)到76.09%（降低了0.59－0.67個(gè)數(shù)量級(jí)），而55.5℃、p H4.96處理25 s，Vp死亡率達(dá)到97.73%（降低了1.34－1.92個(gè)數(shù)量級(jí)）。Castillo等人報(bào)道使用單獨(dú)蒸汽滅菌效果明顯不及乳酸和溫度聯(lián)合的蒸汽滅菌效果［12］。又有人研究也發(fā)現(xiàn)單獨(dú)用p H 2.40乳酸處理15 s后腸炎沙門(mén)菌降低了0.70個(gè)數(shù)量級(jí)，但是當(dāng)用p H 2.40乳酸、82℃、15 s處理后，降低了0.86～1.19個(gè)數(shù)量級(jí)［13］。Ikeda等人研究報(bào)道被單核細(xì)胞增生性李斯特菌人工污染的牛肉經(jīng)過(guò)75℃，30 s處理和p H 2.40、55℃、30 s處理后，菌落數(shù)分別降低了1.4～2和1.8～2.6個(gè)數(shù)量級(jí)［14］。盡管這些研究條件有差異，但是它們和本研究一起證實(shí)了有機(jī)酸處理使較低溫殺菌成為可能。而且本研究還進(jìn)一步驗(yàn)證了建立的條件對(duì)魚(yú)蛋白活性影響不顯著。但是在實(shí)際應(yīng)用中，魚(yú)肉的大小和厚度會(huì)不會(huì)影響滅菌效果，而且Pohlman等人指出當(dāng)使用多種抑菌處理手段時(shí)，處理的順序是很重要的［15］。這需要后續(xù)試驗(yàn)完善。目前有研究報(bào)道3%NaCl相比于2%和1%NaCl使VpO3：K6對(duì)p H和溫度環(huán)境的壓力有很好的耐受力［16］，說(shuō)明鹽度與Vp的耐酸機(jī)制有關(guān)。那么本研究中那些經(jīng)過(guò)處理后近3%存活的Vp，是否也有什么保護(hù)機(jī)制存在，還不清楚，有待進(jìn)一步探討。

［1］Yuan BJ，Dai Y，F(xiàn)u XM，et al.Surveillance on food－borne pathogens in Jiangsu province during 2008－2009［J］.Jiangsu J Prev Med，2010，21（4）：1－3.（in Chinese）

袁寶君，戴月，符曉梅等.江蘇地區(qū)2008年－2009年食源性致病菌監(jiān)測(cè)研究［J］.江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué)，2010，21（4）：1－3.

［2］Su YC，Liu C.Vibrioparahaemolyticus：a concern of seafood safety［J］.Food Microbiol，2007，24（6）：549－558.DOI：10.1016/j.fm.2007.01.005

［3］Sun Y，Oliver JD.Antimicrobial action of some GRAS compounds againstVibriovulnificus［J］.Food Addit Contam，1994，11（5）：549－558.

［4］Andrews LS，Park DL，Chen YP.Low temperature pasteurization to reduce the risk ofVibrioinfections from raw shell－stock oysters［J］.Food Addit Contam，2000，17（9）：787－791.

［5］Li LH，Chen PJ，Li LD，et al.Protein denaturation ofMugil cephalusin refrigeration［J］.J Fisheries China，2001，25（4）：363－366.（in Chinese）

李來(lái)好，陳培基，李劉冬等.鯔在冷凍過(guò)程中蛋白質(zhì)的變性［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2001，25（4）：363－366.

［6］Li CL，Zhou AG，Wang ZS.Developments in anti－bacteria effects and its mechanism research［J］.Feed Industry，2006，27（11）：35－41.（in Chinese）

李成良，周安國(guó)，王之盛.有機(jī)酸的抗菌效應(yīng)及其機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.飼料工業(yè)，2006，27（11）：35－41.

［7］Foster JW.When protons attack：microbial strategies of acid adaptation［J］.Curr Opin Microbiol，1999，2（2）：170－174.DOI：10.1016/S1369－5274（99）80030－7

［8］Russell JB.Another explanation for the toxicity of fermentation acids at low p H：anion accumulation versus uncoupling［J］.J Appl Microbiol，1992，73（5）：363－370.DOI：10.1111/j.1365－2672.1992.tb04990.x

［9］Foegeding PM，Busta FF.Chemical food preservatives［M］.In：Disinfection，sterilization and preservation，Philadelphia：Lea ＆Febiger，1991：802－832.

［10］Tomotake H，Koga T，Yamato M，et al.Antibacterial activity of citrus fruit juices againstVibriospecies［J］.J Nutr Sci Vitaminol（Tokyo），2006，52（2）：157－160.DOI：10.3177/jnsv.52.157

［11］Li JR，Li TT，Li XP.Advances in methods for evaluating freshness of aquatic products［J］.J Beijing Technol Business Univ（Nat Sci Ed），2010，28（6）：1－8.（in Chinese）

勵(lì)建榮，李婷婷，李學(xué)鵬.水產(chǎn)品鮮度品質(zhì)評(píng)價(jià)方法研究進(jìn)展［J］.北京工商大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，28（6）：1－8.

［12］Castillo A，Lucia LM，Goodson KJ，et al.Decontamination of beef carcass surface tissue by steam vacuuming alone and combined with hot water and lactic acid sprays［J］.J Food Prot，1999，62（2）：146－151.

［13］Ozdemir H，Yildirim Y，Kuplulu O，et al.Effects of lactic acid and hot water treatments onSalmonellaTyphimuriumandListeriamonocytogeneson beef［J］.Food Contr，2006，17：299－303.DOI：10.1016/j.foodcont.2004.11.003

［14］Ikeda JS，Samelis J，Kendall PA，et al.Acid adaptation does not promote survival or growth ofListeriamonocytogeneson fresh beef following acid and nonacid decontamination treatments［J］.J Food Prot，2003，66（6）：985－992.

［15］Pohlman FW，Stivarius MR，McElyea KS，et al.The effects of ozone，chlorine dioxide，cetylpyridinium chloride and trisodium phosphate as multiple antimicrobial interventions on microbiological，instrumental color，and sensory color and odor characteristics of ground beef［J］.Meat Sci，2002，61（3）：307－313.DOI：10.1016/S0309－1740（01）00198－X

［16］Whitaker WB，Parent MA，Naughton LM，et al.Modulation of responses ofVibrioparahaemolyticusO3：K6 to p H and temperature stresses by growth at different salt concentrations［J］.Appl Environ Microbiol，2010，76（14）：4720－4729.DOI：10.1128/AEM.00474－10