陳 挺，張必利，何 平，程 平，鄭 興

家族性心室預(yù)激、傳導(dǎo)系統(tǒng)病變及心肌肥厚在2002年首次被歸結(jié)為分子遺傳學(xué)疾病，并被統(tǒng)稱為PRKAG2心臟綜合征。這是一種少見(jiàn)的常染色體顯性遺傳性疾病，主要由于編碼腺苷-磷酸激活的蛋白激酶γ2調(diào)節(jié)亞單位基因的PRKAG2發(fā)生錯(cuò)義突變，例如，有人認(rèn)為該基因R302Q位點(diǎn)突變與預(yù)激有關(guān)［1-2］?；颊邥?huì)出現(xiàn)陣發(fā)性室上性心動(dòng)過(guò)速，需安裝永久起搏器，同時(shí)有可能伴有心肌肥厚、左室功能障礙等臨床表型［3-4］。本研究擬通過(guò)構(gòu)建含有突變位點(diǎn)R302Q的PRKAG2的真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究基因PRKAG2 R302Q突變的功能以及PRKAG2心臟綜合征的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Top10，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室制備;真核表達(dá)載體 pIRES2-EGFP(Clontech公司);KOD高保真DNA聚合酶(TOYOBO公司);限制性內(nèi)切酶Nhe I、BamH I(Fermantas公司);T4DNA連接酶(NEB公司);普通質(zhì)粒小抽試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和PCR清潔試劑盒(Axygen公司);Trizol試劑(Invitrogen公司);逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 設(shè)計(jì)用于PCR擴(kuò)增人野生型PRKAG2基因(NCBI基因ID號(hào)51422)CDS區(qū)的引物，ATG起始位點(diǎn)前增加Kozak序列GCCACC，引物名稱及序列:F1，5'-GTCAGCTAGCGCCACCATGGGAAGCGCGGTTATGG-3';R1，5'-TGTAGGATCCTCACTCCGTTTCTGTCTCCTTTTGT-3';設(shè)計(jì)R302Q定點(diǎn)突變引物，突變位點(diǎn)位于引物中間位置，引物名稱及序列:RQ1，5'-GCCAACGGTGTCCGAGCAGCGCCACTGT-3';RQ2，5'-ACAGTGGCGCTGCTCGGACACCGTTGGC-3'，以上引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2 人野生型基因 PRKAG2的克隆 用 Trizol法抽提健康人全血mRNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1條鏈，采用F1/R1特異引物PCR擴(kuò)增目標(biāo)序列，PCR 體系:cDNA 0.5 μl，F(xiàn)1 引物 0.5 μl，R1 引物0.5 μl，KOD DNA 聚合酶 0.5 μl，濃度 2 mmol/L 的dNTP 2 μl，濃度 25 mmol/L 的 MgSO41 μl，10 × KOD Buffer 2.5 μl，無(wú)菌雙蒸水加至 25 μl。反應(yīng)體系在冰上配制，混勻，瞬時(shí)離心后置于PCR儀，95℃預(yù)變性 5 min 后;95℃變性30 s，55℃退火30 s，68℃延伸90 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);最后68℃延伸5 min。目標(biāo)片段回收，經(jīng)Nhe I、BamH I雙酶切連接至pIRES2-EGFP載體中，篩選陽(yáng)性克隆測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3 人突變型基因 PRKAG2 R302Q的克隆(1)PCR分段擴(kuò)增引入突變序列。以人野生型PRKAG2基因?yàn)槟０?，分別采用F1/RQ2、RQ1/R2 2對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物分別命名為RSa、RSb。擴(kuò)增結(jié)束后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物全部上樣，用1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下切割目的片段，膠回收試劑盒純化。PCR體系及反應(yīng)條件:模板pPRKAG2-IRES2-EGFP質(zhì)粒 0.1 μl，F(xiàn)1/RQ1 0.5 μl，RQ22/R1 0.5 μl，KOD DNA 聚合酶 0.5 μl，濃度 2 mmol/L 的 dNTP 2 μl，濃度 25 mmol/L 的 MgSO41 μl，10 × KOD Buffer 2.5 μl，無(wú)菌雙蒸水加至25 μl。反應(yīng)體系在冰上配制，混勻，瞬時(shí)離心后置于PCR儀，95℃預(yù)變性5 min后;95℃變性30 s，56℃退火30 s，68℃延伸60 s，進(jìn)行30 個(gè)循環(huán);最后68℃延伸5 min。(2)PCR拼接獲得PRKAG2 R302Q全長(zhǎng)。將上述純化得到的2個(gè)分段PCR產(chǎn)物RSa、RSb作為模板，采用F1/R1引物PCR擴(kuò)增，得到PRKAG2 R302Q基因片段，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物全部上樣，用1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下切割目的片段，膠回收試劑盒純化。PCR體系及反應(yīng)條件:模板RSa 0.5 μl，模板 RSb 0.5 μl，F(xiàn)1 0.5 μl，R1 0.5 μl，KOD DNA 聚合酶1 μl，濃度 2 mmol/L 的 dNTP 4 μl，濃度25 mmol/L 的 MgSO42 μl，10 × KOD Buffer 5 μl，無(wú)菌雙蒸水加至50 μl。反應(yīng)體系在冰上配制，混勻，瞬時(shí)離心后置于PCR儀，95℃預(yù)變性5 min后;95℃變性30 s，56℃退火30 s，68℃延伸2 min，進(jìn)行30 個(gè)循環(huán);最后68℃延伸5 min。

1.2.4 重組載體 pR302Q-IRES2-EGFP的構(gòu)建(1)酶切、連接、轉(zhuǎn)化。用Nhe I、BamH I雙酶切回收產(chǎn)物R302Q片段和pIRES2-EGFP載體，37℃水浴酶切2 h。酶切體系:10 × TangoTMBuffer 5 μl，Nhe I 2 μl，BamH I 2 μl，R302Q/pIRES2-EGFP 25 μl，無(wú)菌雙蒸水加至50 μl。PCR清潔試劑盒回收酶切基因及載體產(chǎn)物，T4DNA連接酶4℃連接過(guò)夜，得到的質(zhì)粒為pR302Q-IRES2-EGFP。將重組質(zhì)粒42℃熱擊轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。(2)陽(yáng)性克隆鑒定。挑取轉(zhuǎn)化板的單克隆，置于20 μl無(wú)菌水中溶解，取1 μl菌液作模板，特異引物F1/R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取5 μl擴(kuò)增產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。反應(yīng)體系:10×Taq Buffer 2 μl，F(xiàn)1 0.3 μl，R1 0.3 μl，菌液 0.5 μl，Taq 0.3 μl，濃度 2 mmol/L 的 dNTP 2 μl，無(wú)菌雙蒸水加至 20 μl。反應(yīng)體系在冰上配制，混勻，瞬時(shí)離心后置于PCR儀，94℃預(yù)變性5 min后;94℃變性30 s，61℃退火30 s，72℃延伸2 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。挑取PCR鑒定正確的陽(yáng)性克隆進(jìn)一步采用Nhe I、BamH I雙酶切驗(yàn)證后，挑取2個(gè)克隆送Invitrogen公司采用通用引物測(cè)序。Axygen質(zhì)粒小抽試劑盒抽提測(cè)序正確的克隆質(zhì)粒。

2 結(jié)果

2.1 人野生型PRKAG2基因的克隆

Trizol法提取人細(xì)胞mRNA，經(jīng)RT-PCR合成cDNA第1條鏈，特異性引物PCR擴(kuò)增得到PRKAG2基因片段，目的片段條帶在1710 bp左右，酶切連接至pIRES2-EGFP載體中測(cè)序驗(yàn)證，與NCBI公布序列完全一致，表明正確擴(kuò)增出PRKAG2基因片段見(jiàn)圖1。

圖1 人野生型PRKAG2的RT-PCR電泳圖

2.2 人突變型基因PRKAG2R302Q的克隆

以人野生型基因PRKAG2為模板，通過(guò)PCR拼接的方法，分段擴(kuò)增得到PRKAG2R302Q基因2段，大小分別為900 bp與800 bp左右，均與預(yù)期一致。見(jiàn)圖2。膠回收純化克隆得到的基因片段，再分別以以上2個(gè)片段為模板，通過(guò)PCR拼接得到了約1700 bp的目標(biāo)片段，與預(yù)期一致。見(jiàn)圖3。

圖2 PRKAG2的RSa、RSb片段擴(kuò)增結(jié)果

2.3 重組載體pR302Q-IRES2-EGFP的構(gòu)建

以Nhe I、BamH I分別雙酶切 pIRES2-EGFP和上述膠回收片段，1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下切割陽(yáng)性片段，膠回收試劑盒回收酶切片段。經(jīng)T4DNA連接酶連接雙酶切產(chǎn)物，構(gòu)建pR302Q-IRES2-EGFP重組載體。轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆。見(jiàn)圖4。篩選得到的陽(yáng)性克隆進(jìn)一步采用酶切驗(yàn)證。見(jiàn)圖5。挑取2個(gè)陽(yáng)性克隆送Invitrogen公司測(cè)序，結(jié)果與設(shè)計(jì)完全一致。

圖3 PRKAG2 R302Q的RSa、RSb片段拼接電泳圖

圖4 pR302Q-IRES2-EGFP重組載體菌落PCR鑒定結(jié)果

圖5 pR302Q-IRES2-EGFP重組載體酶切鑒定結(jié)果

3 討論

PRKAG2是AMPK γ2調(diào)節(jié)亞基的編碼基因，在心肌和骨骼肌高度表達(dá)［5］。AMPK是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，由α、β、γ亞基組成異質(zhì)三聯(lián)體，在細(xì)胞中作為代謝感受器，監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP比值，通過(guò)調(diào)節(jié)ATP的消耗和產(chǎn)生，在心肌代謝過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在低氧、缺血、肌肉運(yùn)動(dòng)等應(yīng)激情況下，細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP的比值升高，AMP與AMPK的γ亞基結(jié)合，使α亞基的蘇氨酸暴露，通過(guò)上游激酶-AMP激活蛋白激酶激酶(AMP-activated protein kinase kinase，AMPKK)使蘇氨酸磷酸化，AMPK 被激活［6］。AMPK激活后通過(guò)減少維持生命并非必要的ATP消耗，以及通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的攝取和加強(qiáng)氧化分解代謝刺激ATP的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝平衡［7］。

關(guān)于PRKAG2突變對(duì)AMPK功能的影響，在細(xì)胞水平的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染突變型PPKAG2基因的人CCL13 細(xì)胞株的 AMPK 活性降低［8］;而 Arad 等［9］的研究表明，AMPK基礎(chǔ)活性反而增高。Hamilton［10］和Barnes［11］等的研究結(jié)果與Arad的研究結(jié)果一致，并且發(fā)現(xiàn)AMPK對(duì)AMP的敏感性降低。Burwinkel等［12］認(rèn)為，由于不同實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞株不一樣，因此研究結(jié)果不同。CCL13細(xì)胞株中的腫瘤抑制蛋白LKB1是AMPK的主要上游底物，含量與其他細(xì)胞有顯著差異，而突變的AMPK結(jié)構(gòu)基因只有在足量LKB1存在的條件下才能增加AMPK的基礎(chǔ)活性，并降低AMPK對(duì)AMP的敏感性。

研究表明，PRKAG2心臟綜合征患者均有PRKAG2基因突變。所以，對(duì)該基因突變進(jìn)行研究，進(jìn)而闡述其發(fā)病機(jī)制尤為重要。為闡明這種缺陷機(jī)制，Sidhu等制備了表達(dá)人類突變PRKAG2基因的轉(zhuǎn)基因小鼠［13］，轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)的變化表型與人的家系性預(yù)激患者相似。

本研究克隆了突變型人PRKAG2 R302Q基因并構(gòu)建了其真核表達(dá)載體pR302QvIRES-EGFP，后續(xù)可通過(guò)轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，為進(jìn)一步研究PRKAG2 R302Q突變功能奠定了基礎(chǔ)。

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