羅發(fā)興 伍秀英 黃強 李超

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640)

作為自然界中最廣泛的儲能和供能物質(zhì)之一，淀粉因來源廣泛、價格低廉及可再生，被廣泛應(yīng)用于各大工業(yè)及食品領(lǐng)域．淀粉是由葡萄糖單元經(jīng)糖苷鍵連接而成的大分子化合物，其顆粒由無定形區(qū)和半結(jié)晶區(qū)組成，其中無定形區(qū)由不規(guī)則排列的直鏈淀粉和支鏈淀粉組成，而半結(jié)晶區(qū)由結(jié)晶層和無定形層交替形成．結(jié)晶層由支鏈淀粉側(cè)鏈形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)緊密排列而形成，也有部分直鏈穿插其中，使結(jié)構(gòu)更緊密;支鏈淀粉的分枝點及直鏈淀粉則構(gòu)成無定形層［1］．淀粉不僅能為人和動物提供能量，還能在低溫下酶解為葡萄糖和工業(yè)酒精等能源物質(zhì)，這一現(xiàn)象受到越來越廣泛的關(guān)注［2-3］．目前，有關(guān)淀粉顆粒酶解后結(jié)構(gòu)變化的研究已經(jīng)較多，文獻［4-5］研究了不同種類的酶對同種淀粉結(jié)構(gòu)的影響;文獻［3，6-8］研究了淀粉的種類及水解度對結(jié)構(gòu)的影響．但是截至目前，關(guān)于不同加酶量和酶解時間下獲得的水解率相近的淀粉顆粒的聚集態(tài)結(jié)構(gòu)差異的研究卻鮮有報道．文中以普通玉米淀粉為原料，通過改變加酶量和酶解時間來研究其對淀粉顆粒結(jié)構(gòu)的影響，同時采用掃描電子顯微鏡(SEM)、差示掃描量熱(DSC)、小角X射線散射(SAXS)分析等方法對淀粉結(jié)構(gòu)進行表征，以期為酶法淀粉改性提供理論指導(dǎo)．

1 材料和方法

1．1 材料

普通玉米淀粉，吉林中糧生化能源銷售有限公司產(chǎn)品;蘇宏葡萄糖糖化酶(酶活力為100000 U/mL)、ADN04390型中溫α-淀粉酶(酶活力828IU/mL)，諾維信(中國)生物有限公司產(chǎn)品;一水合檸檬酸、磷酸氫二鈉、3，5-二硝基水楊酸等均為市售分析純試劑．

1．2 實驗方法

1．2．1 淀粉的酶解

稱取一定質(zhì)量的普通玉米淀粉溶于pH值為5．0(pH值及反應(yīng)溫度均根據(jù)兩種酶的最佳參數(shù)折中后獲得)的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液中，配成23%(淀粉干基質(zhì)量分?jǐn)?shù))的淀粉乳，加入一定量的復(fù)合酶(α-淀粉酶與葡萄糖糖化酶按體積比1∶3混合［8］)后于50℃恒溫水浴鍋中酶解，反應(yīng)完成后，用5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的鹽酸調(diào)節(jié) pH值至3．0反應(yīng)10min滅酶，用3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的NaOH中和溶液使pH值至6．0，真空抽濾，取濾液進行水解度測定，淀粉用去離子水洗滌3遍，抽濾，濾餅置于45℃的干燥箱中干燥48 h，粉碎，過80目篩，得到淀粉樣品．每個樣品重復(fù)兩次．通過控制加酶量或酶解時間得到水解率接近的微孔淀粉．

1．2．2 水解率的測定

水解率的測定參考文獻［9］的方法，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線 y=6．7851x+0．0038，r2=0．9992．

1．2．3 SEM 分析

采用德國ZEISS公司生產(chǎn)的EVO18型掃描電子顯微鏡進行SEM分析．用導(dǎo)電雙面膠將淀粉均勻分散在樣品臺上，真空條件下將樣品噴金處理，置于掃描電子顯微鏡下觀察，放大2000倍觀察表面形態(tài)并進行拍攝．

1．2．4 DSC 分析

采用美國 Perkin-Elmer公司生產(chǎn)的DSC-8000型差示掃描量熱儀對淀粉樣品進行DSC分析．準(zhǔn)確稱取3mg淀粉于實驗盤中，加入去離子水配成水分含量為75%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的淀粉乳，封盤后放置12 h以平衡水分．以空盤為對照，然后以10℃/min的升溫速率開始掃描，掃描溫度范圍為30～100℃．用Pyris軟件計算起始溫度(to)、峰值溫度(tp)、終止溫度(tc)及相變焓(ΔH)等特征參數(shù)．

1．2．5 SAXS 分析

采用奧地利Anton Paar公司生產(chǎn)的SAXSess型小角X射線散射儀進行SAXS分析，將淀粉樣品與一定量去離子水混合，配成60%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的淀粉乳，平衡8h后，置于毛細(xì)管樣品皿中進行測試．測試條件:波長 =0．1542nm，管壓40kV，管流50mA，樣品與影像板間距21．2mm，曝光時間10min．

2 結(jié)果與討論

2．1 酶解條件對淀粉水解率的影響

酶解時間與淀粉水解率的關(guān)系如圖1所示．由圖1可見，隨著酶解時間的延長，淀粉的水解率增大，按水解速度的快慢可將酶解過程分為兩個階段:前8h水解率增長較快;8h后水解速度減慢，這與文獻［10］的報道一致．這是因為在水解初期酶主要對無定形區(qū)進行水解，而后期主要作用于結(jié)晶結(jié)構(gòu)，由于結(jié)晶結(jié)構(gòu)較致密，因而水解速度減慢．

圖1 酶解時間與淀粉水解率的關(guān)系Fig．1 Relationship between hydrolysis time and hydrolysis degree of starch

加酶量與水解率的關(guān)系如圖2所示．由圖2可見，加酶量小于3．33×10-6L/g(以每克干基淀粉所加酶的量計)時，水解率的增長速度較快，當(dāng)加酶量超過3．33×10-6L/g后，水解速度減慢，且基本保持穩(wěn)定．這可能是因為當(dāng)加酶量低于3．33×10-6L/g時，酶主要作用于淀粉的無定形區(qū)，而當(dāng)加酶量超過3．33×10-6L/g時，淀粉酶更多地向結(jié)晶區(qū)滲透進行水解，所以水解速度減慢．

圖2 加酶量與淀粉水解率的關(guān)系Fig．2 Relationship between the amount of enzyme and hydrolysis degree of starch

2．2 淀粉表面形態(tài)變化

微孔淀粉在不同水解條件下的水解率(DH)如表1所示，水解后淀粉的SEM分析結(jié)果如圖3所示．

表1 淀粉在不同水解條件下的水解率Table 1 Hydrolysis degree of starch samples under different hydrolysis conditions

圖3 不同水解條件下淀粉樣品的SEM照片F(xiàn)ig．3 SEM micrographs of starch samples under different hydrolysis conditions

由圖3可見，隨著水解率增加，淀粉表面微孔的孔徑增大，淀粉顆粒破碎程度加深，從破碎的顆粒中可看到明顯層狀結(jié)構(gòu)，在較高水解率下，破碎的顆粒內(nèi)部出現(xiàn)大的空腔，與“由外至內(nèi)”和“由內(nèi)至外”的水解模式一致［11］．

比較加酶量和酶解時間不同、但水解率相近的樣品(B1與 B2、C1與 C2、D1與 D2)發(fā)現(xiàn)，加酶量多的樣品破碎程度更大，這可能是因為酶的增加導(dǎo)致淀粉表面開孔數(shù)增多［12］，淀粉顆粒結(jié)構(gòu)減弱而破碎;比較水解率較高的D1、D2可發(fā)現(xiàn)，D2破碎程度更為明顯，但酶解時間長的D1中，淀粉顆粒中心部分更多地被水解，形成了大的空腔．

2．3 淀粉熱學(xué)性質(zhì)變化

不同淀粉樣品的熱學(xué)性質(zhì)參數(shù)如表2所示．由表2可見，隨著水解率的提高，to總體升高，這是因為酶進入淀粉顆粒后，優(yōu)先水解無定形區(qū)，從而導(dǎo)致殘余淀粉顆粒的to上升［6］．ΔH與淀粉乳在加熱過程中失去的雙螺旋結(jié)構(gòu)及熔化的單螺旋結(jié)構(gòu)有關(guān)［13］，從表中所示結(jié)果可見，ΔH隨著水解率升高而減小，這與文獻［4，6］的報道一致，這是因為淀粉酶在水解無定形區(qū)的同時也作用于半結(jié)晶區(qū)和結(jié)晶區(qū)，導(dǎo)致酶解后淀粉顆粒中的結(jié)晶總量減少，因此ΔH降低．

水解率均在39%左右的淀粉樣品D1和D2中，D1的ΔH更小，且與D2有顯著差異．這可能是因為水解時間為15．0 h的樣品顆粒內(nèi)部被水解得更多(從SEM照片中可看出)，導(dǎo)致顆粒中心擁有更長B鏈的支鏈淀粉構(gòu)成的雙螺旋結(jié)構(gòu)更多地被水解［14］，從而 ΔH 減小得更多．

表2 不同淀粉樣品的熱學(xué)性質(zhì)1)Table 2 Thermal properties of different starch samples

2．4 淀粉顆粒半結(jié)晶結(jié)構(gòu)的變化

SAXS可用來測量聚合物中結(jié)晶顆粒的大小、晶粒形狀等．通過布拉格定律(d=2/q)可知:SAXS曲線的一個重要特征在于散射結(jié)構(gòu)與對應(yīng)的散射角間的負(fù)相關(guān)關(guān)系，其中d代表散射結(jié)構(gòu)的尺寸或距離，q為相應(yīng)的散射向量．淀粉的SAXS曲線在0．6nm-1左右出現(xiàn)的散射峰被認(rèn)為與淀粉的半結(jié)晶區(qū)有關(guān)［15］，有研究者認(rèn)為該峰的散射強度取決于半結(jié)晶區(qū)中有序結(jié)構(gòu)的量或者無定形背景區(qū)和半結(jié)晶區(qū)(由重復(fù)的結(jié)晶層和無定形層構(gòu)成)間的電子密度差［16］，Blazek 等［15］還認(rèn)為無定形生長環(huán)的水解會導(dǎo)致SAXS曲線在低q區(qū)的散射強度增大．

不同淀粉樣品的SAXS結(jié)果如圖4所示．

圖4 不同淀粉樣品的SAXS曲線Fig．4 SAXS curves of different starch samples

從圖4可以看出，在低q區(qū)原淀粉的散射強度最小，經(jīng)水解后，淀粉在低q區(qū)的散射強度增大;比較水解率相近的淀粉(圖4(a)、(b))，可發(fā)現(xiàn)酶解時間長的樣品在低q區(qū)散射強度更大．而在0．6nm-1處的散射強度最大(4．44)，酶解淀粉的峰值強度減小，且4個酶解樣品中，酶濃度最小的樣品峰值散射強度最大(3．90)，其余3者沒有明顯差別．

酶解后淀粉樣品在低q區(qū)的散射強度增大，而峰值強度減小的實驗現(xiàn)象與之前文獻報道［14，17-18］的一致．Blazek等［15］認(rèn)為這是酶對淀粉無定形生長環(huán)的優(yōu)先水解造成的．結(jié)合圖4，可認(rèn)為在酶解過程中，淀粉的無定形生長環(huán)被優(yōu)先水解，且加酶量和酶解時間對淀粉結(jié)構(gòu)的影響是不一樣的，提高加酶量主要影響半結(jié)晶區(qū)的水解，而延長酶解時間主要影響無定形區(qū)的水解．

另外，由散射強度峰值所對應(yīng)的散射向量q，通過布拉格定律可計算淀粉中半結(jié)晶層的厚度d．從圖4可知，曲線的散射峰位置幾乎無變化，所以酶解對半結(jié)晶層的厚度沒影響．

3 結(jié)論

通過控制酶解時間和加酶量制得相近水解率的微孔淀粉，研究了兩者對淀粉顆粒聚集態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，得出以下結(jié)論:

(1)加酶量多、酶解時間短的微孔淀粉破碎程度高于加酶量少、酶解時間長的樣品;而后者淀粉顆粒的中心部分水解程度高于前者．

(2)隨著水解率的增大，淀粉的焓值(ΔH)減小，在較高酶解程度下，酶解時間長的微孔淀粉焓值下降更明顯，這可能與淀粉顆粒中心部分雙螺旋結(jié)構(gòu)的水解程度有關(guān)．

(3)酶解過程中，淀粉無定形區(qū)和半結(jié)晶區(qū)結(jié)構(gòu)均發(fā)生改變;提高加酶量和延長酶解時間對淀粉結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同的影響，提高加酶量主要影響半結(jié)晶區(qū)的水解，而延長酶解時間主要影響無定形區(qū)的水解．

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