高瑞金 劉 學(xué) 崔衛(wèi)波 譚海明 張碧成 陸倩倩 張雨梅

（揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 江蘇 揚(yáng)州 225009）

血管內(nèi)皮細(xì)胞是鋪陳于血管內(nèi)壁的一層多功能細(xì)胞，在血管通透性屏障、免疫防御及炎性反應(yīng)中起著極其重要的作用[1]。大量研究顯示，血管內(nèi)皮是許多心血管疾病或危險(xiǎn)因子作用的重要靶器官，具有相當(dāng)活躍的內(nèi)分泌和代謝功能。血管內(nèi)皮細(xì)胞具有多重的生物學(xué)特性，而大鼠是主要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，因此建立大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法對(duì)于研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞特性、對(duì)作用于血管的藥物及抗腫瘤藥物的研究具有重要意義。本試驗(yàn)采用植塊法分離大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過條件培養(yǎng)以及CD31免疫組化和管形成鑒定，建立了大鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

Wistar大鼠，雄性，200g左右，揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供。人重組VEGF165，美國(guó)Prospec公司；HGDMEM和胎牛血清(FBS)，美國(guó)Gibco公司；兔抗大鼠CD31抗體，美國(guó)Santa Cruz公司；羊抗兔FITC熒光抗體，瑞士Roche公司；Matrigel基質(zhì)膠，美國(guó)BD公司；Trypsin、Pen/ Strep/ Amphotericin B、戊巴比妥鈉、肝素鈉，生物工程(上海)有限公司；羊抗兔即用型SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、Mayor，s蘇木素均為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品；EDTA、氯化鈉、氯化鉀和磷酸二氫鉀，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；多聚甲醛、甲醇、硫酸銅、碳酸氫鈉和Na2HPO4·12H2O，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離與原代培養(yǎng)Wistar大鼠2%戊巴比妥鈉麻醉后，經(jīng)75%乙醇浸泡消毒后固定在手術(shù)板上，在超凈工作臺(tái)中打開胸腹腔，分離胸主動(dòng)脈。取出胸主動(dòng)脈，用PBS沖洗3～4次后，放入另一個(gè)無菌培養(yǎng)皿中，用眼科鑷小心除去血管周圍結(jié)締組織及脂肪，縱行剖開血管，用眼科剪分割成2mm×2mm大小的血管塊，將血管塊內(nèi)皮面向下貼于鋪有明膠的50ml培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置2h后，加入適量含20%FBS、4ng/mlVEGF165和100μg/ml肝素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)[2-4]，液體僅遮蓋主動(dòng)脈即可。培養(yǎng)4d后，棄去主動(dòng)脈植塊，2～3d換液1次。

1.2.2 傳代培養(yǎng) 原代細(xì)胞培養(yǎng)約12～14d，遷出生長(zhǎng)的細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)瓶面積的2/3以上時(shí)即可傳代[3]。棄去培養(yǎng)液，用PBS沖洗培養(yǎng)瓶后，加0.25%胰蛋白酶消化3～5min，見內(nèi)皮細(xì)胞收縮變圓，立即加入等體積的含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，吸管輕輕吹打并混勻，移入10ml離心管中，1000r/min離心10min，棄上清，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液適量制成細(xì)胞懸液，分至2個(gè)50ml培養(yǎng)瓶中。根據(jù)內(nèi)皮細(xì)胞貼壁時(shí)間快于成纖維細(xì)胞，因此傳代4h后換液以除去未貼壁雜細(xì)胞，以后隔天換液1次。

1.3 細(xì)胞鑒定

1.3.1 細(xì)胞形態(tài) 倒置顯微鏡下觀察不同代次的細(xì)胞形態(tài)，是否呈現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞典型的折光性強(qiáng)、“鋪路石”樣等特點(diǎn)[3, 5]。

1.3.2 CD31免疫細(xì)胞分析 取2代細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液后分于放有蓋玻片的六孔板中，進(jìn)行細(xì)胞爬片培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至80%左右取出蓋玻片，PBS清洗3次，用4%多聚甲醛固定30min，PBS清洗后滴加0.5%Triton-X100 10min；PBS清洗后加3%H2O220min，PBS再次清洗后加5%BSA封閉30min。滴加兔抗鼠CD31一抗4℃過夜，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。第2天經(jīng)PBS清洗后分別滴加羊抗兔二抗及羊抗兔FITC熒光二抗，進(jìn)行DAB顯色和熒光細(xì)胞分析。

1.3.3 內(nèi)皮細(xì)胞的管形成 96孔板中先加入50μl基質(zhì)膠于37℃培養(yǎng)箱中30min，后每孔加入1×104個(gè)第2代細(xì)胞懸液100μl，使細(xì)胞在基質(zhì)膠表面均勻散開，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2h后觀察細(xì)胞形成的管狀結(jié)構(gòu)。

1.4 內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

原代細(xì)胞及傳代培養(yǎng)的細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至2×105個(gè)/ml。24孔板每孔中加入細(xì)胞懸液100μl，含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基900μl，于37℃、5%CO2培養(yǎng)。第2天開始，每天4孔連續(xù)計(jì)數(shù)6d，分別繪制2～6代細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)皮細(xì)胞分離及形態(tài)

主動(dòng)脈塊培養(yǎng)4d時(shí)，可見動(dòng)脈塊附近有原代內(nèi)皮細(xì)胞遷出生長(zhǎng)，細(xì)胞呈梭狀或多角。培養(yǎng)12～14d，遷出生長(zhǎng)的細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)瓶面積的2/3以上，可見血管內(nèi)皮細(xì)胞的“鋪路石”樣特征，見圖1。

圖1 大鼠胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(×100)

2.2 CD31免疫細(xì)胞分析

CD31抗體免疫細(xì)胞化學(xué)（1）SABC顯色，可見胞漿中淡黃棕色陽性細(xì)胞[6]；（2）FITC熒光二抗分析，可見胞漿中綠色熒光強(qiáng)陽性細(xì)胞，見圖2。

圖2 大鼠胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞CD31免疫化學(xué)(×200)

2.3 內(nèi)皮細(xì)胞管形成

從大鼠胸主動(dòng)脈分離的原代內(nèi)皮細(xì)胞及傳代培養(yǎng)細(xì)胞，在Matrigel基質(zhì)膠中培養(yǎng)2h后，均可見形成部分管狀結(jié)構(gòu)；至培養(yǎng)6h可見形成完整的血管樣小管。

2.4 內(nèi)皮細(xì)胞傳代培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線

大鼠胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行了六代傳代培養(yǎng)，不同代次細(xì)胞形態(tài)上無變化，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線見圖4。細(xì)胞于分瓶后4天至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在相同培養(yǎng)時(shí)間不同代次細(xì)胞數(shù)無明顯差異(P>0.05）。

圖3 大鼠胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞管形成(×50)

圖4 內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

3 討論

內(nèi)皮細(xì)胞的獲取方法主要包括機(jī)械刮取法、酶消化法和植塊法[7]。大鼠主動(dòng)脈管腔較細(xì)酶消化法操作難度較大，獲取內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量較少，而機(jī)械刮取法獲得的內(nèi)皮細(xì)胞摻雜較多的雜細(xì)胞，本研究采用植塊法獲取的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量多，通過培養(yǎng)基中添加VEGF細(xì)胞因子、肝素等物質(zhì)可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)為優(yōu)勢(shì)細(xì)胞，從而保證了內(nèi)皮細(xì)胞的純度；而傳代過程中采用的差速消化法，內(nèi)皮細(xì)胞脫壁時(shí)間早于成纖維細(xì)胞，在內(nèi)皮細(xì)胞脫壁時(shí)成纖維細(xì)胞仍處于貼壁狀態(tài)，可以進(jìn)一步除去雜細(xì)胞，獲得純度較高的內(nèi)皮細(xì)胞。

血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記物有第Ⅷ因子、CD31、vWF、CD34、VEGFR和Weibel-Palade小體等[8-10]。CD31作為成熟內(nèi)皮細(xì)胞表面分子標(biāo)志物之一，近年來較多的被用于內(nèi)皮細(xì)胞的的鑒定。本試驗(yàn)采用CD31免疫SABC組化及免疫熒光抗體分析對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行鑒定，內(nèi)皮細(xì)胞陽性率較高，管形成試驗(yàn)也進(jìn)一步驗(yàn)證了分離培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的特性。

[1]黃麗英. 血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)及CXCL16對(duì)其影響的研究[D].云南昆明: 昆明醫(yī)學(xué)院, 2003.

[2]遲曉艷, 徐金青, 高文武. 兔主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離與體外培養(yǎng)[J]. 魯東大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2011, 27(1): 55- 57.

[3]楊翠燕, 王金鳳, 張艷萍等. 大鼠胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)和純化鑒定[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2010, 35(2): 195-196.

[4]Mika K, Kenji I, Eiji W, Et al. A simple method of isolating mouse aortic endothelial cells [J]Journal of Atherosclerosis and Thrombosis,2004, 12(3):138-142.

[5]姜文. 大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法研究[J]. 中外醫(yī)學(xué)研究, 2011, 9(10):3-4.

[6]Cynthia AF and Charles WP. Isolation and culture of rat microvascular endothelial cells [J]. In Vitro Cell Dev Biol～Animal, 2002, 38:208-212.

[7]陳瑞華, 趙自剛, 牛春雨等. 大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)[J]. 實(shí)驗(yàn)研究, 2007, 11(1):16-18.

[8]Pisacane AM, Picciotto F, Risio M. CD31 and CD34 expression as immunohistochemical markers of endothelial transdifferentiation in human cutaneous melanoma[J].Cell Oncol, 2007, 29(1):59-66.

[9]高航, 關(guān)春艷. 兔主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定: 內(nèi)皮細(xì)胞分離方式及培養(yǎng)條件的改良[J]. 中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù), 2010, 14(11):1919-1922.

[10]吳金義, 張蕾，張秀英等. 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定技術(shù)[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué) 2010, 4(14):511-513.