代紅艷　于翠梅等

摘 要：【目的】探索以原核表達(dá)的草莓輕型黃邊病毒（SMYEV）外殼蛋白（CP）為抗原制備抗血清的方法，從而建立利用ELISA檢測SMYEV的技術(shù)體系?！痉椒ā坷肐PTG誘導(dǎo)SMYEV CP重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，分離純化重組蛋白并以其為抗原對(duì)新西蘭兔進(jìn)行免疫。血清效價(jià)達(dá)到要求后，分離純化抗血清并利用DAC-ELISA對(duì)草莓植株進(jìn)行SMYEV檢測，同時(shí)利用RT-PCR對(duì)DAC-ELISA檢測結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證?！窘Y(jié)果】宿有SMYEV CP基因的大腸桿菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后出現(xiàn)一條52.0 ku左右的特異性重組蛋白譜帶，以純化的重組蛋白為抗原制備出專一性較強(qiáng)的針對(duì)SMYEV的抗血清，該抗血清稀釋800倍后仍能有效檢測草莓植株中的SMYEV。利用DAC-ELISA和RT-PCR對(duì)26份草莓試材分別進(jìn)行SMYEV檢測，2種檢測方法的檢測結(jié)果基本一致?！窘Y(jié)論】以原核表達(dá)的SMYEV CP為抗原可以制備出專一性較強(qiáng)、效價(jià)較高的SMYEV的抗血清。

關(guān)鍵詞： 草莓輕型黃邊病毒（SMYEV）； CP； 原核表達(dá)； 抗血清； ELISA

中圖分類號(hào)：S668.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980？穴2013？雪04-0578-04

草莓輕型黃邊病毒（Strawberry mild yellow edge virus， SMYEV）是一種嚴(yán)重危害草莓生產(chǎn)的病毒，通過蚜蟲持久性傳播，在世界上廣泛分布[1]。SMYEV歸屬于馬鈴薯X病毒屬（Potexvirus），其病毒粒子為線形，基因組為1條單鏈RNA，全長約6 000個(gè)核苷酸，包含5個(gè)開放閱讀框（ORF）[2]。隨著SMYEV在世界各地廣泛傳播，SMYEV生物學(xué)特性也不斷變化，不同分離物在不同草莓病毒指示植物上癥狀表現(xiàn)多樣，這為病毒鑒定、病害防治帶來了困難[3]。

病毒檢測是病毒研究的一項(xiàng)重要內(nèi)容，簡單、快速、靈敏的病毒檢測方法的建立對(duì)于病毒病的防治具有重要意義。早期檢測SMYEV的方法為指示植物小葉嫁接法，其周期長，檢測效率較低[1]。近年來，RT-PCR成為SMYEV檢測的主要方法[4-6]。利用RT-PCR檢測病毒具有靈敏度高、周期短、試材用量少等優(yōu)點(diǎn)，但是成本較高，而且對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件和操作人員的素質(zhì)要求也較高?；诳寡宓拿嘎?lián)免疫吸附分析（ELISA）是病毒檢測中常用的方法之一，具有快速、成本低廉、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可以大規(guī)模應(yīng)用于植物病毒的檢測[7]。應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測病毒的前提條件是具有該病毒的抗血清。傳統(tǒng)的病毒抗血清制備是以純化病毒粒子為抗原，SMYEV在草莓植株內(nèi)含量較低，病毒粒子的純化很困難[8]。以原核表達(dá)病毒外殼蛋白（coat protein， CP）為基礎(chǔ)的抗血清制備，克服了傳統(tǒng)通過提純病毒粒子并以病毒粒子為抗原制備抗血清的種種弊端，并且能夠大量獲得特異性高的抗血清。這種技術(shù)已在柑橘速衰病毒（Citrus tristeza virus）[9]、沙地葡萄莖痘伴隨病毒（Rupestris stem pitting associated virus）[10]、蘋果褪綠葉斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus）[11]、蘋果莖痘病毒（Apple stem pitting virus）[12]等果樹病毒上獲得成功。

在克隆SMYEV分離物SY05的CP基因全長并實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌中表達(dá)重組蛋白的基礎(chǔ)上[13]，我們從大腸桿菌細(xì)胞中純化SMYEV CP，并制備其抗血清，比較分析抗血清檢測病毒與RT-PCR檢測病毒的一致性與靈敏性，為通過ELISA技術(shù)大規(guī)模檢測SMYEV奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

用于SMYEV檢測方法比較分析的草莓試材有26份，分為兩類：一類是離體保存的試管苗，品種為‘布蘭登堡；另一類是草莓田間植株，包括25個(gè)品種。

1.2 SMYEV CP在原核細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)及電泳分析

1.3 抗血清制備

從菌液中分離純化重組蛋白，然后以重組蛋白為抗原對(duì)2只成年新西蘭兔進(jìn)行免疫。初次免疫時(shí)將重組蛋白1 mL（1 g·L-1）與弗氏完全佐劑1∶1混勻后，用5 mL注射器進(jìn)行背部多點(diǎn)注射。初次免疫后每2周加強(qiáng)免疫一次，加強(qiáng)免疫用同樣量重組蛋白與不完全弗氏佐劑1∶1混合后背部皮下多點(diǎn)注射。每次加強(qiáng)免疫后14～15 d，從耳緣靜脈取血液1 mL，常規(guī)方法分離血清，用間接ELISA法測定血清效價(jià)。血清效價(jià)達(dá)到要求后，取血并按照常規(guī)方法分離純化抗血清。

1.4 DAC-ELISA檢測SMYEV

1.5 RT-PCR檢測SMYEV

2 結(jié)果與分析

2.1 SMYEV原核表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

2.2 SMYEV抗血清的制備

2.3 SMYEV抗血清在病毒檢測時(shí)的應(yīng)用效價(jià)

2.4 ELISA與RT-PCR檢測SMYEV效果比較

利用DAC-ELISA和RT-PCR分別對(duì)26份草莓材料進(jìn)行SMYEV檢測。DAC-ELISA檢測結(jié)果顯示，3份草莓材料攜帶SMYEV，分別是：‘布蘭登堡、‘JA3田間苗和‘布蘭登堡組培苗。RT-PCR 檢測結(jié)果表明，3份ELISA檢測表現(xiàn)陽性的試材在RT-PCR檢測中也全部為陽性，但是有1份試材，即‘幸香田間苗，在DAC-ELISA檢測中表現(xiàn)為陰性，而在RT-PCR檢測中為陽性。

3 討 論

ELISA方法因操作簡便、成本低等特點(diǎn)適宜病毒的大規(guī)模檢測，特異性抗血清的制備是其能否應(yīng)用的關(guān)鍵。由于SMYEV在草莓的病毒含量極低，病毒粒體為柔軟的線條形，進(jìn)行病毒粒子純化時(shí)，病毒粒體間易相互聚集，易被污染，因此通過病毒粒子的分離和提純制備抗血清相當(dāng)困難[8]。Jawee等[16]以昆諾藜中純化出的SMYEV病毒粒子為抗原制備了SMYEV抗血清，但ELISA檢測草莓田間帶病毒材料時(shí)只在一定時(shí)期內(nèi)（1月至5月）效果較好。本研究改變傳統(tǒng)的以病毒粒子為抗原制備抗血清的方法，采用基因工程技術(shù)，利用原核表達(dá)的SMYEV的CP為抗原制備抗血清，克服了SMYEV病毒粒子難以分離提純的困難，而且純化的重組CP蛋白相對(duì)于提純的病毒粒子而言，不含寄主植物的任何成分，不受寄主蛋白的干擾，所以所制備的抗血清特異性強(qiáng)。

本研究比較了ELISA與RT-PCR檢測SMYEV技術(shù)的效果，結(jié)果表明1個(gè)RT-PCR檢測陽性的樣本未能通過ELISA檢測出來，其可能的主要原因是ELISA檢測病毒的靈敏度低于RT-PCR。Hu等[17]在檢測香蕉植株中黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus）的研究中發(fā)現(xiàn)，RT-PCR檢測CMV的靈敏性比ELISA高100倍，而Sanchez-Navarro等[18]在PNRSV上檢測得到類似的結(jié)果。另一個(gè)可能的原因是血清型差異。目前GenBank中已報(bào)道SMYEV CP基因序列近30個(gè)，不同分離物間序列變異較大，存在較多插入、缺失位點(diǎn)，不同分離物核苷酸序列同源性也存在較大差異，因此SMYEV很可能存在血清型差異，從而影響ELISA檢測病毒的效果。

參考文獻(xiàn) References：

[1] LAMPRECHT S， JELKMANN W. Infectious cDNA clone used to identify strawberry mild yellow edge associated potexvirus as causal agent of the disease[J]. Journal of General Virology， 1997， 78： 2347 -2353.

[2] THOMPSON J R， JELKMANN W. Strain diversity and conserved genome elements in Strawberry mild yellow edge virus[J]. Archives of Virology， 2004， 149（10）： 1897-1909.

[3] YANG Hong-yi， DAI Hong-yan， LI Li-li， ZHANG Zhi-hong. Diversity of the 3' terminal sequence of Strawberry mild yellow edge virus genome[J]. Acta Phytopathologica Sinica， 2008， 38（1）： 96-99.

楊洪一， 代紅艷， 李麗麗， 張志宏. 草莓輕型黃邊病毒3′末端序列多態(tài)性研究[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 2008， 38（1）： 96-99.

[4] THOMPSON J R， WETZEL S， KLERKS M M， VALKOVA D， SCHOEN C D， SPAK J， JELKMANN W. Multiplex RT-PCR detection of four aphid-borne strawberry viruses in Fragaria spp. in combination with a plant mRNA specific internal control[J]. Journal of Virological Methods， 2003， 111（2）： 85-93.

[5] CHANG L， ZHANG Z， YANG H， LI H， DAI H. Detection of strawberry RNA and DNA viruses by RT-PCR using total nucleic acid as a template[J]. Journal of Phytopathology，2007，155（7-8）： 431-436.

[6] YANG Hong-yi， ZHANG Zhi-hong， GAO Xiu-yan， DU Guo-dong， DAI Hong-yan， LI He. Detection of Strawberry mild yellow edge virus with RT-PCR and analysis of the sequences of 3' terminal region[J]. Acta Horticulturae Sinica， 2005， 32（3）： 403-407.

楊洪一， 張志宏， 高秀巖， 杜國棟， 代紅艷， 李賀. 草莓輕型黃邊病毒的RT-PCR檢測及其3′端序列分析[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2005， 32（3）： 403-407.

[7] LOMMEL S A， MCCAIN A H， MORRIS T J. Evaluation of indirect enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses[J]. Phytopathology， 1982， 72（8）： 1018-1022.

[8] SPIEGEL S. Double-stranded RNA in strawberry plants infected with strawberry mild yellow-edge virus[J]. Phytopathology，1987，77（10）：1492-1494.

[9] NIKOLAEVA O V， KARASEV A V， GUMPF D J， LEE R F， GARNSEY S M. Production of polyclonal antisera to the coat protein of citrus tristeza virus expressed in Escherichia coli： Application for immunodiagnosis[J]. Phytopathology， 1995， 85： 691-694.

[10] PETROVIC N， MENG B， RAVNIKAR M， MAVRIC I， GONSALVES D. First detection of Rupestris stem pitting associated virus particles by antibody to a recombinant coat protein[J]. Plant Disease， 2003， 87（5）： 510-514.

[11] GENG Chao， MOU An-li， LIU Zhi-qiang， LI Xiang-dong， ZHOU Tao. Preparation of antiserum to apple chlorotic leaf spot virus with coat protein expressed in E. coli[J]. Journal of Fruit Science， 2012， 29（5）： 755-758.

耿超， 牟安麗， 劉志強(qiáng)， 李向東， 周濤. 蘋果褪綠葉斑病毒外殼蛋白基因的原核表達(dá)及抗血清制備[J]. 果樹學(xué)報(bào)， 2012， 29（5）： 755-758.

[12] LI Li-li， ZHANG Zhi-hong， DONG Ya-feng， ZHANG Zun-ping， FAN Xu-dong， PEI Guang-qian. Prokaryotic expression of apple stem pitting virus coat protein and antiserum preparation[J]. Acta Phytophylacica Sinica， 2010， 37（4）： 319-324.

李麗麗， 張志宏， 董雅鳳， 張尊平， 范旭東， 裴光前. 蘋果莖痘病毒外殼蛋白的原核表達(dá)及抗血清制備[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2010， 37（4）： 319-324.

[13] YU Cui-mei，ZHANG Zhi-hong，LIU Yue-xue，MA Yue，LI He，DAI Hong-yan. Cloning，sequence analysis and prokaryotic expression of coat protein gene of Strawberry mild yellow edge virus[J]. Acta Agriculturae Boreali-Sinica， 2012， 27（1）： 30-34.

于翠梅， 張志宏， 劉月學(xué)， 馬躍， 李賀， 代紅艷. 草莓輕型黃邊病毒CP基因的克隆、序列分析及原核表達(dá)[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)， 2012， 27（1）： 30-34.

[14] ALJANABI S M， PARMESSUR Y， MOUTIA Y， SAUMTALLY S， DOOKUN A. Further evidence of the association of a phytoplasma and a virus with yellow leaf syndrome in sugarcane[J]. Plant Pathology， 2001， 50（5）： 628-636.

[15] HOBBS H A， REDDY D V R， RAJESWARI R， REDDY A S. Use of direct antigen coating and protein A coating ELISA procedures for detection of three peanut viruses[J]. Plant Disease， l987， 71： 747-749.

[16] JAWEE A， ADAMS A N. Serological detection of strawberry mild yellow edge-associated virus[J]. Acta Horticulturae， 1995， 385： 98-104.

[17] HU J S， LI H P， BARRY K， WANG M， JORDAN R. Comparison of dot blot， ELISA， and RT-PCR assays for detection of two cucumber mosaic virus isolates infecting banana in Hawaii[J]. Plant Disease， 1995， 79（9）： 902-906.

[18] SANCHEZ-NAVARRO J A， APARICIO F， ROWHANI A， PALLAS V. Comparative analysis of ELISA， nonradioactive molecular hybridization and PCR for the detection of prunus necrotic ringspot virus in herbaceous and Prunus hosts[J]. Plant Pathology， 1998， 47（6）： 780-786.